Биологический каталог




Фотобиология

Автор С.В.Конев, И.Д.Волотовский

их энергию ионизации, времени жизни возбужденного состояния и вязкости среды, которые определяют вероятность взаимодействия фотоэлектрона с благоприятной диполь-конфигурацией. При этом диполи растворителя как бы притягивают к себе электрон возбужденной молекулы.

Итак, опыты с модельными соединениями при низких температурах убедительно продемонстрировали принципиальную возможность ионизирующего действия ультрафиолетового света на триптофан как по однокван-товому (в условиях, приближающихся к физиологическим), так и по двухквантовому механизму:

So+hv -+Sl^ -АН+ + es\

SQ + hv -> 5* -> Tx -+Tt + hvt T2 -> • AH+ + es.

Хотя кинетика фотоионизации триптофанилов непосредственно в белке не исследовалась, экспоненциальный

характер их фотодеструкции (как и всего процесса фотоинактивации белков) позволяет прийти к следующему заключению. Если в физиологических условиях белок действительно инактивируется в результате фотоионизации, то эта реакция осуществляется по одноквантовому механизму через синглетные возбужденные состояния.

В дальнейшем, как полагает Ю. А. Владимиров и др., образующийся в белках катион-радикал диссоциирует на протон и нейтральный радикал. Последний, взаимодействуя с соседними группами полипептидной цепи, образует межмолекулярную ковалентную сшивку — стабильный фотопродукт:

, +в • АН+ ^ Н+ + • А —^А-В (сшивка).

Если фотолизу подвергается остаток триптофана, непосредственно входящий в состав активного центра фермента, уже этого достаточно, чтобы белок потерял ферментативную активность.

Если существенный триптофанил находится вне активного центра, то сшивка изменяет баланс водородных, гидрофобных и других слабых сил (множественные разрывы связей), поддерживающих нативную конформацию макромолекулы. В результате инициируется кооперативный процесс денатурации, которая и приводит к потере ферментативной активности. В большинстве случаев непосредственной причиной инактивации являются конформационные изменения макромолекулы. Действительно, фотоинактивации белка сопутствуют конформационные перестройки и оба эти эффекта наблюдаются при одинаковых дозах УФ-света. УФ-индуцированные конформационные перестройки в белках зарегистрированы с помощью методов седиментации, электрофореза, вискозиметрии, полярографии, электронной микроскопии, люминесценции, оптического вращения, осмометрии, кондуктометрии, измерений поверхностного натяжения, растворимости, скорости дейтериевого обмена, устойчивости к протеолитическим ферментам и теплу, количества титруемых кислых, основных и SH-групп, изучения иммунологических свойств.

В ряде работ отмечается четкая корреляция между степенью инактивации и денатурации белков. Однако не для всех белков и не при всяких условиях к инактивации ведут генерализованные по всей структуре конформационные перестройки. Иногда бывает достаточно локальных структурных изменений. Так, инактивация уреазы и трипсина не нарушает их комплексирования с антителами, а квантовый выход фотоденатурации трипсина, по данным седиментации, в 2—5 раз ниже квантового выхода фотоинактивации. По данным Аугенштейна, эффективная энтальпия (Д#*) активации ингибирования трипсина УФ-светом сильно зависит от химической природы субстрата, по деструкции которого оценивается остаточная ферментативная активность. Было показано, что для этилового эфира бензоиларгина и казеина АЯ* составляет соответственно 2,5 и 4,7 ккал/моль. Поскольку в опытах Аугенштейна субстрат добавлялся после облучения фермента, то фотофизика и фотохимия инактивации белка во всех случаях были одинаковы, а наблюдавшиеся различия в квантовых выходах инактивации указывали на локальный характер нарушения конформа-ции, которое по-разному сказывалось на центрах сорбции субстратов.

По-видимому, фотоденатурация (локальная или генерализованная) белков может осуществляться и нефотохимическим путем, минуя стадии лабильных и стабильных фотопродуктов при тепловой диссипации энергии электронно-возбужденных состояний триптофанилов (около 100 ккал/моль), ведущей к множественным разрывам водородных и иных связей. Так, было обнаружено, что аргиназа и уреаза, обладающие, как и другие белки, способностью к существованию в двух дискретных функционально активных конформациях в области физиологически умеренных температур (кооперативный переход А^В), различаются по квантовым выходам фотоинактивации температурных конформеров А и В. Однако скорости фотолиза триптофанилов и цистина, а также природа конечных стабильных фотопродуктов (данные люминесценции) у температурных конформеров оказались одинаковыми. Отсюда следует, что различия в фоточувствительности конформеров могут быть связаны с дополнительной нефотохимической инактивацией макромолекулы.

Скорее всего по этой же причине происходит уменьшение ?акт фотоинактивации (А,= 254 нм) трипсина после дейтерирования, соответствующее, по данным ИК-спек-троскопии, разности энергии N—Н- и N—D-колебаний. Иными словами, у дейтерированного трипсина облегчен разрыв водородных связей энергией, поглощенной цистином. Сходным образом может быть объяснено уменьшение квантового выхода фотоинактивации трипсина на фоне постоянной скорости фотолиза триптофанилов при изменении вязкости и ионного состава среды, амилазы при образовании фермент-субстратного комплекса, а также гексокиназы при ее комплексировании с регуля-торным гормоном инсулином.

Можно думать, наконец, что и отмеченная ранее Мак Лареном сильная зависимость квантовых выходов инактивации белков от рН, ионной силы и состава буфера связана не только с характером их воздействия на фотохимические реакции, но и с изменением вероятности прямой тепловой фотоденатурации.

6. ЦИСТИНОВАЯ ФОТОИНАКТИВАЦИЯ

Поглощение квантов УФ-света цистином сопровождается возникновением свободных радикалов с локализацией неспаренного электрона на атоме серы (R—S- и R—S—S). Методом электронного парамагнитного резонанса такие радикалы обнаружены как в модельных соединениях (цистин, цистеин, глютатион), так и в белках. Проведенный Дозе химический анализ фотохимических продуктов показал, что при фотолизе цистина разрываются S—S-связи:

+ 2Н

R — S — S — R-J-/tv —* 2R — SfJ.

Эта реакция восстановления цистина до цистеина идет, следовательно, через стадию образования свободных радикалов.

Квантовый выход фотолиза цистина в растворе на два-три порядка выше, чем триптофана, и составляет, по данным Дозе, Мак Ларена и Льюза, 0,11 и 0,13 соответственно. В белках квантовый выход фотолиза цистина еще выше и колеблется от 0,18 в инсулине до 0,75 в химотрипсиногене. Возбужденные молекулы цистина в растворе способны диссоциировать не только по —S—S—, но и по —С—S—связи:

_С — S-S —С — — CH-f-C-S-S — Н.1-2Н

Фотолиз дисульфидной связи может происходить при поглощении квантов как самим цистином, так и ароматическими аминокислотами. На это указывает возрастание квантового выхода фотолиза цистина в белках при переходе от облучения с длиной волны 254 нм к облучению с длиной волны 280 нм (с расчетом только на его собственное поглощение). Аналогичная сенсибилизация наблюдается и в модельных системах — смеси цистин + -Ьтриптофан и цистин-f-тирозин, причем квантовый выход сенсибилизации достигает 0,02.

Очевидно, причиной такой сенсибилизации не может быть индуктивно-резонансная миграция энергии от ароматических аминокислот к цистину, поскольку энергетический уровень возбужденного состояния последнего располагается выше, чем энергетический уровень ароматических аминокислот. Остаются две возможности:

1) фотопродукты ароматических кислот вступают в химическую реакцию с соседними цистиновыми остатками;

2) электроны, «выбитые» из триптофана, мигрируют к дисульфидным связям и восстанавливают их. Действительно, по данным Гроссвейнера, добавление цистина к индолу приводит к исчезновению фотоиндуцированного спектра поглощения сольватированных электронов. Регистрируется также переходное поглощение с максимумом при 420 нм, приписываемое промежуточному продукту взаимодействия цистина и сольватированного электрона— дисульфидному аддукту. Это означает, что цистин эффективно захватывает «выбитые» из индола электроны.

Однако некоторые факты не удается объяснить сенсибилизированным фотолизом цистина. Показано, например, что квантовый выход образования дисульфидных аддуктов гораздо ниже квантовых выходов фотолиза цистина и образования нейтральных радикалов триптофана в белках, из чего следует, что только небольшая доля «выбитых» из триптофана электронов «захватывается» цистином и поэтому дисульфидные аддукты не могут быть главным интермедиатом в реакции фотолиза ди-сульфидных связей. Найдено и другое объяснение значительному различию квантовых выходов фотолиза цистина в растворе и белке. Согласно Диксону и Гранту, в белках протекает не миграция сольватированного электрона к цистину, а имеет место лишь торможение рекомбинации радикальных продуктов цистина.

Как и для триптофана, для цистина характерна гетерогенность по фоточувствительности даже в пределах одной и той же макромолекулы белка. По данным Ауген-штейна, Дозе, Мак Ларена и Льюза, различные —S—S—группы в белковой макромолекуле имеют неодинаковые квантовые выходы фотолиза. Так, в трипсине и рибонуклеазе фоточувствительность некоторых остатков в 5 раз отличается от усредненной фоточувствительности цистина в белке. Как и в случае триптофана, разрывы —S—S—связи цистина, входящего в активный центр, приводят к инактивации белка.

7. ДРУГИЕ ВИДЫ ПОВРЕЖДЕНИЙ БЕЛКА

В литературе дискутируется вопрос о возможности образования сшивок между различными белковыми макромолекулами. Подобные сшивки могут иметь значение при плотной упаковке белков в надмолекулярных структурах клетки, например в мембране.

У белков, в состав которых входит металл, играющий существенную роль в каталитической активности, к фотоинактивации приводит его «выбивание» из макромолекулы. Такая ситуация имеет место при УФ-облучении карбоксипептидазы, теряющей в результате разрушения существенного триптофанила атом цинка. Наконец, Л. П. Каюшиным было обнаружено, что свет, поглощ

страница 47
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69

Скачать книгу "Фотобиология" (3.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2019)