Биологический каталог




Фотобиология

Автор С.В.Конев, И.Д.Волотовский

т увеличивать поперечное сечение ключевой фотохимической реакции и разобщать в пространстве место поглощения кванта и место реализации его действия. Наоборот, межмолекулярная миграция энергии белок — внешний хромофор уменьшает квантовый выход фотохимического повреждения белкового носителя и может сенсибилизировать в акцепторах фотохимические реакции, ответственные за многие фотобиологические эффекты.

5. ТРИПТОФАНОВАЯ ФОТОИНАКТИВАЦИЯ

Триптофановая фотоинактивация белков в растворе и в пленке при облучении УФ-светом с длиной волны 260—320 нм осуществляется по одноквантовому, одно-ударному механизму. В пользу этого свидетельствуют экспоненциальный характер дозных кривых и взаимозаменяемость интенсивности и времени облучения (соблюдение закона Бунзена — Роско). Триптофановая инактивация белков инициируется не триплетными, а синглет-ными электронно-возбужденными состояниями хромофоров. Этот вывод следует из пропорциональности между концентрацией синглетных возбужденных состояний и степенью инактивации. Миграционная «откачка» энергии с синглетных уровней триптофанилов у трипсина на краситель флуоресцеин, а у фибриногена — на диметил-аминонафталинсульфанилхлорид сопровождается соответствующим уменьшением квантового выхода инактивации белков. В противоположность этому изменение заселенности триплетных уровней триптофанилов белка в результате индуктивно-резонансной миграции энергии триптофанил->хризоидин и сульфонамид-^триптофанил не влияет на фоточувствительность белков.

Более того, даже при низких температурах (77К), при которых стационарная концентрация «триплетов» и, следовательно, вероятность триплетной фотоинактивации на несколько порядков выше, чем при комнатных, сохраняется одноквантовость процесса. В этих же условиях равные дозы прерывистого и непрерывного облучения оказываются одинаково эффективными, хотя в последнем случае условия более благоприятны для триплетной фотохимии.

Характерно, что и сам фотолиз триптофанилов (их фотовыцветание, регистрируемое по тушению флуоресценции) в белках также протекает по одноквантовому одноударному механизму.

Для некоторых белков, однако, полулогарифмическая зависимость степени фотолиза триптофанилов от дозы УФ-облучения описывается не одной, а двумя прямыми с изломом на начальных стадиях фотолиза. Это указывает на «гетерогенность триптофанилов по фоточувствительности — «быстрые» и «медленные» трипто-фанилы (Л. X. Эйдус, Т. Н. Калабухова).

Итак, при физиологических условиях именно синг-летное возбужденное состояние триптофанила в белках является, по-видимому, непосредственным предшественником фотопродуктов, которые приводят к инактивации макромолекулы.

В опытах Ю. А. Владимирова с сотр. убедительно показано, что триптофан может участвовать в двух реакциях фотохимического разрушения. Реакция 1 характерна для свободной аминокислоты в растворе, а реакция 2 — для остатков триптофана в белке. Хотя обе реакции приводят к тушению триптофановой флуоресценции (образующиеся фотопродукты не флуоресцируют в свойственной для аминокислоты спектральной области), по своей природе они существенно различаются между собой. Во-первых, квантовый выход реакции 2 мало зависит от содержания кислорода, а реакция 1 резко усиливается в его присутствии; во-вторых, скорости реакций 1 и 2 по-разному зависят от концентрации водородных ионов в среде (рН); в-третьих, стабильные фотопродукты реакций обладают неодинаковыми спектрами поглощения. Это означает, что реакции 1 и 2 приводят к образованию различных стабильных фотопродуктов.

По-видимому, в реакции 1 разрывается пиррольное (но не бензольное) кольцо индола. При этом образуются формилкинуренин, кинуренин, оксикинуренин и окси-антраниловая кислота — конечный стабильный продукт фотодеградации триптофана в обычных условиях.

Реакция 2, судя по спектрам поглощения, не сопровождается разрывом индольного кольца, а приводит к образованию ковалентной связи (сшивки) между имин-ным азотом индола и соседними группами белковой макромолекулы. В пользу этого свидетельствуют исчезновение полосы поглощения >NH-rpynnbi в инфракрасном спектре у глицил-триптофана и тушение флуоресценции (фотовыцветание). Однако этот конечный стабильный фотопродукт триптофана, который, по-видимому, приводит к фотоинактивации белков, не выделен и его химическая природа пока не ясна.

Образованию конечного стабильного фотопродукта предшествует возникновение ряда первичных (промежуточных) лабильных фотопродуктов свободнорадикаль-ной природы. Появление в белках при УФ-облучении свободных радикалов триптофана зарегистрировано с помощью методов электронного парамагнитного резонанса, фотохемилюминесценции и фототермолюмине-сценции. Определение их природы стало возможным благодаря использованию низких температур, способствующих накоплению и стабилизации лабильных фотопродуктов.

С помощью различных методических приемов и подходов удалось выяснить, что в этих условиях основной первичной фотореакцией триптофана в белке является его фотоионизация—отрыв электрона от азота имино-группы с образованием катион-рад икала и сольватиро-ванного электрона по схеме

АН -f hv-* • АН+ + е5.

При отрыве протона от катион-радикала возникает нейтральный радикал: АН+-*- -А+Н+. Другой путь дезактивации катион-радикала — его взаимодействие с ОН-ионами с образованием реакционных ОН-аддуктов.

Нейтральные радикалы триптофана зарегистрированы Гроссвейнером с сотр. в различных белках методом флеш-фотолиза. Данные радикалы характеризуются переходным поглощением с максимумом при 510 нм. Их образование протекает с участием иминогруппы индоль-ного кольца, так как у 1-метилтриптофана переходное поглощение при 510 нм не регистрируется.

Наряду с данными флеш-фотолиза индикатором свободнорадикальных продуктов и их превращений в УФ-облученных белках служит рекомбинационное послесвечение, возникающее при взаимодействии катион-радикала с сольватированным электроном. Этот процесс значительно ускоряется при подогреве образца или подсветке желтым светом, поглощаемым сольватированны-ми электронами. Последовательность событий при рекомбинации промежуточных лабильных фотопродуктов может быть проиллюстрирована следующими реакциями:

77K

• АН"*" -f- es *? AHV -> АН -f- hvt (послесвечение);

80—11 OK

• АН+ -f- es >? AHV -»? AH -f- hv1 (термолюмииесценция);

• AH^" -f es —? AH -f- hv2 (индуцированная светом люминесценция).

Рассмотрим механизм образования катион-радикала ?АН+ Фотоионизация триптофана в замороженных водно-буферных растворах протекает по однокваитово-му механизму. Это следует из линейной зависимости интенсивности термолюминесценции от интенсивности возбуждающего света и интенсивности индуцированной видимым светом люминесценции как от интенсивности возбуждающего света, так и интенсивности подсветки в желтой области спектра. Увеличение темнового интервала между возбуждающим (ультрафиолетовым) и индуцирующим (желтым) импульсами в пределах времени жизни триплетов триптофана (6 с) не приводило к возрастанию интенсивности индуцированной люминесценции. Поскольку интенсивность индуцированной люминесценции является показателем концентрации катион-радикалов -АН+ это указывает на образование •АН+ не через триплетное, а через синглетное возбужденное состояние триптофана. Однако в сильнощелочных растворах триптофана зависимость светосуммы термолюминесценции и поглощения сольватированных электронов при 600 нм от интенсивности возбуждающего света характеризуется квадратичной зависимостью v = f(I2), где v — светосумма термолюминесценции или оптическая плотность сольватированных электронов, а / — интенсивность возбуждающего света. Иными словами, в сильнощелочных замороженных растворах фотоионизация представляет собой двухквантовый процесс, в котором второй квант поглощается, по-видимому, триплетной молекулой триптофана. При этом электрон отрывается от молекулы триптофана, находящейся во втором триплетном электронно-возбужденном состоянии.

Для водно-солевых (NaCl) замороженных растворов триптофана показатель степени в приведенной выше формуле варьировал от 1 до 2 в зависимости от способа приготовления образца: наблюдалось «смешивание» одноквантовой и двухквантовой фотохимии в различных пропорциях.

Итак, электрон может успешно отрываться как от синглетной, так и от триплетной возбужденной молекулы триптофана в зависимости от условий микроокружения — матрицы.

На первый взгляд возможность отрыва электрона от синглетной возбужденной молекулы триптофана противоречит законам термодинамики. Известно, что энергия ионизации ароматических соединений в вакууме обычно равняется 9 эВ, а нижнему колебательному подуровню синглетного возбужденного состояния триптофана соответствует энергия 4,1 эВ. Поэтому кажется, что возбужденная молекула триптофана не должна ионизироваться.

Однако в реальных условиях потенциал ионизации триптофана значительно снижается. Это обусловлено тем, что одновременно с процессом ионизации происходит выделение энергии электронной и ориентационной поляризации среды (4 эВ), возникающей в результате взаимодействия диссоциирующих партнеров с молекулами окружения. Следует учитывать также, что потенциал ионизации n-электрона азота индольного кольца значительно меньше потенциала ионизации jt-электронов. Этот потенциал еще больше уменьшается в результате образования водородной связи с участием иминогруппы. Поэтому наиболее вероятно, что электрон отрывается от азота индольного кольца.

Можно представить себе, что фотоионизация осуществляется по следующему механизму. Электрон возбужденной молекулы за время жизни возбужденного состояния успевает вступить во взаимодействие с диполями растворителя, находящимися в наиболее благоприятной конфигурации. В результате этого энергия связи электрона с молекулой оказывается меньшей, чем сумма энергий возбужденного состояния и взаимодействия с растворителем. Отрыв электрона становится энергетически возможным. Следовательно, вероятность отрыва электрона от молекулы зависит не только от энергии возбужденного состояния, но и от полярности и поляризуемости среды, снижающ

страница 46
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69

Скачать книгу "Фотобиология" (3.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2019)