приближается к одинарной. Это способствует ее «разрыву» и замыканию межтиминовых связей благодаря «электронным вакансиям» (высокой спиновой плотности). По данным Пюльмана, способность различных пиримидинов к димеризации удовлетворительно коррелирует с рассчитанными для них квантовомеханическими характеристиками. С помощью приближенного метода расчета (самосогласованное поле) В. И. Данилов пришел к выводу, что наилучшие условия для димеризации создаются в три-плетном, а не в синглетном состоянии. Это хорошо согласуется с приведенными выше экспериментальными данными.

Итак, большинство экспериментальных данных свидетельствует о триплетом механизме образования тиминовых фотодимеров. Тем не менее вероятность протеДимер Эксимер Зкситан Шолароданные мономеры

Рис. 46. Кривые потенциальной энергии взаимодействия между молекулами тимина (Lamola А., 1968)

кания реакции фотодимеризации через синглетное состояние, особенно при благоприятных физических и физико-химических условиях, остается достаточно высокой.

По мнению Ламолы, характер взаимодействия между двумя молекулами тимина при условии оптимального стерического соответствия зависит от расстояния

о

между партнерами (рис. 46). При расстоянии 3—4,5 А наблюдается экситонное взаимодействие с заселением обоих уровней экситонного состояния. Если молекулы

о

сближаются еще больше (^2,8 А), из нижнего экситонного состояния возникают эксимеры, которые переходят прямо в димер.

5. ДИМЕРИЗАЦИЯ ТИМИНА В ОБЕЗВОЖЕННЫХ ПЛЕНКАХ

И СПОРАХ

При облучении твердых пленок тимидина, а также спор бактерий, обладающих повышенной резистентно-стью, образуется нециклобутановый димер — 5-тиминил-5,6-дигидротимин

О О

Образованию этого продукта в спорах способствует, по-видимому, особая конформация ДНК, характерная для спор.

6. ДИМЕРИЗАЦИЯ УРАЦИЛА

Фотодимеры урацила с циклобутановым кольцом выделены и идентифицированы при УФ-облучении урацила или его производных в замороженных и водных растворах урацилсодержащих динуклеотидов, полиуридино-вой кислоты, РНК вируса табачной мозаики, транспортной и рибосомальной РНК:

Из четырех теоретически предсказанных стереоизо-меров урацила при облучении образуется в основном цис-изомер типа

н н

Как и в случае тимина, димеризация урацила фотообратима. Квантовые выходы прямой и обратной реакций зависят от длины волны света. Их максимальные значения для полиурациловой кислоты составляют 0,1 (Я=248 нм) и 0,45 (Я=230 нм) соответственно. Скорость бимолекулярной, но одноквантовой реакции фо« тодимеризации урацила обнаруживает явно выраженную зависимость от его концентрации в растворе, возрастая в 2 раза для уридил-2/-(3/) -фосфата при переходе от 10~4 до 10~2 моль/л. По-видимому, фотоди-меризация урацила, как и тимина, протекает через его триплетное состояние, на что указывает уменьшение скорости димеризации в присутствии триплетных тушителей и ее увеличение при избирательном заселении триплетных уровней с помощью сенсибилизаторов.

На основании данных по тушению Браун и Джонс оценили время жизни триплетного состояния урацила в 2 • 10-5, а Шетлар — в 10~7 с.

7. ДИМЕРИЗАЦИЯ ЦИТОЗИНА

Фотодимеризация цитозина обнаружена при УФ-об-лучении цитозина, цитидил-цитидина, полиуридилцити-диловой кислоты и ДНК:

Квантовый выход димеризации возрастает в 9 раз при увеличении рН от 3,0 до 6,5. Фотодимеры цитозина под действием коротковолновых лучей мономеризу-ются. Димеры цитозина неустойчивы и в темноте могут мономеризоваться или дезаминироваться, превращаясь в урациловые димеры. Вследствие высокой лабильности цитозиновых димеров их пространственную структуру установить до сих пор не удалось.

8. СМЕШАННАЯ ДИМЕРИЗАЦИЯ ОСНОВАНИЙ

При облучении растворов нуклеотидов и ДНК образуются смешанные тимин-цитозиновый, тимин-урацило-вый и урацил-цитозиновый димеры. Смешанный тимин-цитозиновый димер практически не мономеризуется под действием света и представляет собой граяс-изомер. На первый взгляд кажется странным образование в ДНК тимин-урацилового димера, поскольку известно, что ура-цил не входит в состав ДНК. Это противоречие объясняется следующей схемой:

3 1 I

*Т —У,I —NHC

тимин -f цитозин + свет -> Т — Ц

+ОН

т. е. темновым дезаминированием цитозина до урацила в составе смешанного димера.

9. ПИРИМИДИНОВЫЕ АДДУКТЫ

Кроме циклобутановых пиримидиновых димеров при УФ-облучении нуклеотидов могут образовываться различные гомо- и гетеродимеры, получившие название пи-римидиновых аддуктов. При этом, например, из двух тиминовых оснований образуется нециклическая димер-ная структура

О

и

характеризующаяся иными, чем у тимина, спектральными свойствами: полоса поглощения аддукта сдвинута в длинноволновую сторону примерно на 40 нм.

По сравнению с пиримидиновыми димерами количество аддуктов, возникающих при УФ-облучении, невелико. Аддукты возникают, по-видимому, не через триплетное, а через синглетное состояние, так как добавление доноров триплетного состояния тимина не сенсибилизирует их образование.

10. ГИДРАТАЦИЯ УРАЦИЛА И ЦИТОЗИНА

Реакция фотогидратации сводится к присоединению воды к пиримидиновому кольцу у 5,6-двойной связи с ее последующим разрывом:

Фотогидраты образуются в растворах урацила и цитозина, их ди- и полинуклеотидах (нуклеозидах), РНК и ДНЮ Характерно, что пиримидиновые гидраты эффективно образуются в одно-, но не двухтяжевой ДНК. Скорость фотогидратации уменьшается при замене НгО на D2O. Реакция гидратации фотонеобратима. Поэтому при длительном или интенсивном ультрафиолетовом облучении (240—270 нм) полиуридиловой кислоты практически обнаруживаются только гидраты.

В отличие от димеров гидраты разрушаются в темноте при повышенных температурах, при сдвигах рН как в щелочную, так и в кислую сторону, при повышении ионной силы раствора. Квантовый выход фотогидратации урацила в растворе 0,002, в полиуридиловой кислоте 0,01. Есть все основания считать, что предшественником фотогидратов служат не триплетные, а сш-глехные возбужденные состояния пиримидиновых оснований, поскольку, во-первых, выход фотогидратации не зависит ох,длины волны света, в то время как вероятность конверсии в триплетное состояние зависит от нее; во-вторых, триплетные тушители, влияя на скорость димеризации, оказываются неэффективными по отношению к гидратации; в-третьих, избирательное заселение триплетных уровней оснований за счет миграции энергии не сопровождается гидратацией.

11. ТАУТОМЕРИЗАЦИЯ ОСНОВАНИЙ

Квантовомеханические расчеты показывают, что благодаря изменениям конфигурации электронного облака оснований в первом возбужденном состоянии и связанному с ними изменению энергии резонанса повышается вероятность образования обычно редких тауто-мерных форм оснований (лактим-лактамиая и амино-иминная таутомерная фототрансформация). Возбуждение способствует сдвигу равновесия в системе к редкой лактимной форме (R— С=0—»-R'— С — ОН) у гуанина, урацила и тимина и к иминоформе (R — NH2—>• —^R'=NH) у аденина и цитозина, благодаря чему при репликации становится возможной комплементация цитозина не с гуанином, а с аденином и гуанина не с цитозином„ а с тимином. Однако короткие времена жизни возбужденных состоянии оснований (т^10~12 с) делают проблематичным сохранение сдвига равновесия таутомерных форм в течение репликации,

12. РАЗРЫВЫ ПОЛИНУКЛЕОТИДНОЙ ЦЕПИ

Разрывы сахаро-фосфатного остова ДНК (чаще всего только одной нити) наблюдаются лишь при действии больших доз ультрафиолетового излучения с квантовым выходом, но крайней мере, на три порядка меньшим, чем в случае димеризации пиримидинов. Например, квантовый выход разрывов цепи ДНК вируса табачной мозаики 3,5-Ю-6. В результате разрывов увеличивается вязкость, уменьшается двулучепреломление в потоке и скорость седиментации. Разрывы нитей можно наблюдать под электронным микроскопом.

13. ВНУТРИ- И МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПОПЕРЕЧНЫЕ СШИВКИ В ДНК

О внутримолекулярных ковалентных сшивках между двумя комплементарными нитями ДНК в растворе свидетельствует тот факт, что УФ-облученная ДНК неспособна расплетаться на нити при денатурационных воздействиях — разрыве водородных и других некова-лёнтных связей. Такие «сцепленные» нити выявляются при центрифугировании в градиенте плотности, а также в опытах с использованием ДНК, одна из цепей которых мечена по азоту (N15). Облученные, а затем денатурированные молекулы ДНК устойчивы к действию фосфодиэстеразы, субстратом которой является одно-нитевая ДНК.

Используя способность акридинового оранжевого в комплексе с двунитевой ДНК флуоресцировать в красной, а в комплексе с однонитевой ДНК—в зеленой области спектра, Г. Б. Завильгельский показал, что время жизни флуоресценции в красной области увеличивается, а в зеленой уменьшается с увеличением дозы (возрастание степени локального расплетения нитей); зависимость тех же параметров от дозы облучения была обратной в опытах, проведенных по схеме облучение — нагревание до 100° С — быстрое охлаждение — измерение (уменьшение степени термической денатурации из-за возрастания числа межнитевых сшивок). Как и еледовало ожидать, экспоненциальные кривые время жизни флуоресценции — доза в первом и втором вариантах опытов, начиная с определенных доз, сливались, выходя на плато, так как двунитевые участки ДНК стабилизировались поперечными сшивками и были уже не чувствительными к температуре.

Спектр действия образования поперечных сшивок совпадает со спектром поглощения тимидина, что также подтверждает предположение о димерной (Т — Т) природе поперечных сшивок. Кроме того, показано, что квантовый выход образования сшивок тем выше, чем больше в ДНК содержится аденииа и тимина. Как и димеры тимина, сшивки фотореактивируются.

Остается, однако, неясной природа межмолекулярных сшивок, возникающих при УФ-облучении сухих препаратов ДНК и головок сперматозоидов лосося, в которых молекулы ДНК, как известно, плотно упакованы. Выявить такие сшивки при облучении растворов ДНК не удалось. Следовательно, межмолекулярные ДНК — ДНК сшивки эффективно образуются при облучении подсушенных, но не влажных клеток, вирусов и ДНК. Они