Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

стеме разделения. Следовательно, прежде чем проводить разделение, необходимо удалить специфическую макромолекулярную часть из модифицированного материала без разрушения связи метки с соответствующей субъединицей.

,<4 ) тРНК ?< содержит в 8-ом положении уридин модифицированный NjC6H4COCH2 -группу

(5) BrCH2-c' JQ

сн

г ^

(6) CtCH2CH2 у-л XI CfCH2CH2 4-' TIH-CH-C^

сн2 ^"««^

(?) nh2-ch-c:

с2)

сн.

?' >-C~CH2 ?? о

ВгСН2

с=о о

NH-CH-CH2-0-P-0-CH2

I I

сн2

O-tRNA

он он

Рис. 96. Расположение активных центров между о- и /^-убъедмницами фенила.лннил-тРНК сннтетнзы из E.roli

Из-за маленького количества каждой фракции чувствительность должна быть на уровне радиоактивного пли флуоресцентного метода. При использовании полимерного лигаида, который необходимо удалять, надо, чтобы метка находилась в самой реакционноепособиой группе, а пе в удгитяемой полимерной части аффинного реагента.

Приведем в качестве примера распределение активных центров между а- и ?-субъединицами феиплаланил-тРИК епптетазы из E.coli (рис. 96). Этот фермент

? lie

катализирует связывание фепилалапппа с тРНК в присутствии А'ГР в качестве донора энергии (см. § 5.6). 13 качестве промежуточного соединения образуется фенилаланиладеиилат. Из рис. 96 видно, что фотореакционноспособпый м-азпдо-фенилаланин, аналог фепилалапппа, модифицирует а-субъедипицу. Аденознн-5 -триметафосфат, аналог АТР, и К-бромацстплфепилалапиладопнлат, аналог промежуточного соединения, модифицируют как ?-, так и /tf-суСъедпнпцу. Это означает, что соответствующие активные центры локализуются в области контакта 334

субъединиц, позволяя реагентам атаковать обе субъедпцицы. Производные тРНК, содержащие фотореактпвиые азпдогруппы внутри остатка тРНК (тРНК, обработанная NaCgll.iCOCIIoBr, чтобы проалкплпровать остаток тпоурпдппа по положению 8), и М-а-бромацетилфенилалапил-тРПК (НгСПЛК)-Phe—lliNA) модифицировали ?-субъединицу. Однако аналогичное производное, по с существенно большим реак-ционноспособным остатком, присоединенным к ?-??? >-группе, — хлорамбуци-лил—Phe—tRNAp—(С1СН2СН2)'..К—Со1Ц—(С,Н2)з—0(0)—PJie—tBA'A - модифицирует главным образом а-субъедпшщу. Это означает, что остаток тРНК с присоединенным фенилаланином локализуется па /3-субъедпппце, по не слишком далеко от границы субъединицы, позволяя таким образом длинному остатку достигнуть о-субъ-единицы.

Задачи

7.1. Синтез ряда производных олигонуклеотндов проводят, активируя концевой 5 -фосфат имидазолом. В ходе получения Р-имидазолида

— ° О n{^)n- P-O-dT-O-P-OdT о" о"

образуется побочный продукт — дизамещеиный пирофосфнт:

8 »

"О—Р—0—dT—О—Р—O-dT I I

"О- jj"-0-11 ?—0—P^-p-dT

О сг

На рис. 97 приведен профиль олюцпи полученной реакционной смеси при апионообмеиной хроматографии. Определите, какому соединению соответствует каждый пик, н оцените выход основного продукта реакции.

Количество вещества, вышедшего с колонки, пропорционально площади пика, которая рассчитывается как произведение высоты на'ширину па полувысото пика.

7.2. Для определения молярного кох|крпциента поглощения гексадекапуклеотид Pолпза в тон же кювете она составила 1,8585. Определите молярный коэффициент поглощения при 200 нм для данного олигонуклеотида, если молярные коэффициенты поглощения для нуклеозидов при 260 нм следующие (М-'-см"1): ?. = 15,4· Ю3; ?„ - 7,4· Ю*; = 11,5-103; ?,., = 8,7-103.

А С ь I

7.3. Для выделения эндонуклеазы рестрикции SfaNl, узнающей последовательность GCATC—

_CQTAQ__' ист1ользовали аффинную хроматографию. С этой целью к полимерному

носителю был ковалентно присоединен через 5 '-концевую фосфатную группу один из

?

1

Рис. 97. Профиль элюции реакционной смеси, полученной при синтезе Р-ими-дазолида d(pTpT) при анионообменной хроматографии

Рис. 98. Профиль элюции с аффинного сорбента олигонуклеотида II при элюировании 3 моль/л раствором мочевины

олигонуклеотидов дуплекса, а именно pTTGGATGACGCATCTT (Г). При добавлении комплементарного олигонуклеотида pAACATGCGTCATCCAA (II) происходит образование комплекса и формируется сайт узнавания для рестриктазы. Для аффинной колонки предварительно определяют емкость по сорбируемому олигоиуклеотиду (единица оптической плотности — о.е. — соответствует количеству поглощающего вещества, которое, будучи растворено в 1 мл растворителя в кювете с толщиной слоя 1 см, дает величину оптической плотности 1). Для этого на колонку, содержащую 15 мг аффинного сорбента, наносят 3 о.е. второго олигонуклеотида в условиях образования дуплекса. Колонку промывают ЗМ мочевиной (денатурирующие условия), комплекс разрушается, и весь связавшийся олигонуклеотид элюируется с колонки. На рис. 98 представлена хроматограмма. Известно, что скорость движения бумажной ленты 2 мм/мин, скорость элюции 50 мкл/мпн.

Рассчитайте количество связавшегося олигонуклеотида и емкость сорбента.

7.4. Для исследования химической модификации ДНК в составе хроматина используют меченый [32Р]-олигонуклеотид, содержащий па концевом фосфате апкилирующую группу. Какова должна быть удельная активность меченого олигонуклеотида, чтобы можно было детектировать модификацию 0,1 о.е. ДНК (? = 7-10jM"1cmm нуклеотид), если известно, что степень модификации (отношение количества реагента к количеству нуклеотидов в ДНК) не ниже 10"е? Для модификации использовали производное гс-ксадекатимпдп.пата (pdT)i6 (? = 155· 103M"'cm"1). Эффективность света 40%, фон счетчика 20 импульсов в минуту. Счет образца должен превышать фон не меньше чем в 10 раз.

7.5. Для диагностирования инфаркта миокарда определили концентрацию миоглобина в сыворотке крови трех пациентов с использованием'антител, содержащих флуоресцентную метку (комплекс Ей11). Флуоресценцию измеряли на флуориметре, работающем как счетчик фотонов. Предварительно была измерена флуоресценция для образцов, содержащих .известное количество миоглобина, получены следующие результаты:

336

1 0(фон) 31,20 62,00 125 250 500 1000

5057 43,235 76 550 133 675 238 347 427 101743 121

Постройте калибровочную кривую в логарифмических координатах и определите концент^ рацию миоглобина в сыворотке крови пациентов, если были получены следующие относительные интенсивности флуоресценции: 31 844, 79 763, 608 174.

7.6. Для определения аминокислотной последовательности рибосомальный белок L32 был расщеплен на фрагменты двумя различными методами (А, Б) й для полученных фрагментов методом Эдмана была определена первичная структура. Для метода А получены 12 фрагментов:

1. CAEIAHNVSSKNRKAIVERAAQLAIRVW

2. LVHNVKELEVLLMCNKSY

3. HAALRPLVKPKIVKKRV

4. RKPRGIDNRVRRRF

5. NPNARLRSEENE

6. KGQILHPNIGY

7. KH1LPSGF

8. IRHQSDRY

9. VKIKRNV

10. GSNKKV

11. RKF

12. KKF

Для метода Б получено 4 фрагмента:

1. ИAALRPLVKPKIVKKPVKKFIWIQSDRYVKIKRNVRKPRGIDNRVRRRFKGQILH

2. CNKSYCAEIAHNVSSKNRJC AI VERA AQLAIRVVNPNARLRSEENE

3. LPSGFRKFLVHNVKELEVLLIH

4. PNIGYGSNKKVKHM

С помощью каких методов было проведено расщепление белка? Воспроизведите аминокислотную последовательность рибосомального белка L32, исходя из двух наборов фрагментов, полученных разными методами. Сколько пептидных фрагментов будет получено, если белок подвергнуть расщеплению гидролитическим ферментом трипсином?

7.7. Определение молекулярной массы фермента фенилаланин^гРНК-синтетазы из Thermits thermophilus проводили двумя методами: гель-фильтрацией на декстрановом геле Sephacryl-S-300 шведской фирмы и гель-олектрофорезом на поли-акриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Молекулярная масса ? натив-ного белка при определении гель-фильтрацией найдена равной 245 кДа*. В денатурирующих условиях при гель-электрофорезе белок разделился на две полосы. Для определения молекулярной массы этих полипептидов в денатурирующих условиях проводили гель-электрофорез калибровочных белков (т.е. белков с известной молекулярной массой). Для

*Дальтон (Да, или Da) — единица молекулярной массы биополимера, равная Vl2 массы атома 12С (1 дальтон = 1,661-10"24 г).

337

Концентрация

миоглобина,

мг/мл . .··. .?......

Относительная

интенсивность

флуоресценции ¦ ¦ ¦

всех белков из результатов гель^лектрофореза были определены относительные значен Rf электрофоретической подвижности относительно белка химотрипсиногена (белок наименьшей массой). Для калибровочных белков получены следующие значения Rf.

Белок Молекулярная масса, кДа */ Белок Молекулярная масса, кДа */

Химотрипсиноген о-Субъединица 25 40 1 0,81 ^-Субъединица 90 0,49

РНК-полимеразы /?-Субъединица 155 0,29 Миозин Каталаза 220 СО 0,16 0,69

? '-Субъединица 155 0,31 Овальбумин 45 0,82

Для Rf определяемых белков получены значения 0,49 (о-субъединица) и 0,84 {?-субъ-единица). Интенсивности окраски полос красителем, используемым дня проявления белков, относятся приблизительно как 1:2. Постройте калибровочную кривую в координатах lg ? - Rf. Определите молекулярную массу неизвестных белков. Что можно сказать о субъединичном составе фенилаланин-тРПК-синтетазы?

7.8. Для рибосомного белка S2 малой субъединицы печени крысы получены значения константы седиментации 2J2S, коэффициент диффузии ? = 5,88 см-'/с и парциальный

удельный объем V = 0,739 мл/г. Найдите молекулярную массу белка и отношение f/fQ найденного коэффициента вязкого трения к рассчитанному по уравнению Стокса.

ГЛАВА 8 ОСНОВЫ БИОЭНЕРГЕТИКИ

Живые организмы представляют собой термодинамически неустойчивые системы. Для их формирования и функционирования необходимо непрерывное поступление энергии в форме, пригодной для многопланового использования. Поскольку временной масштаб биохимических превращений, восприятия и передачи сигналов, двигательных процессов таков, что за это время изменения внешнего давления и температуры незначительны, то с до

страница 82
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(30.05.2017)