Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

инности) лиганда к биополимеру, то этот процесс называют аффинной модификацией. Процесс позволяет ввести радиоактивные, флуоресцентные, парамагнитные и другие метки в определенную область биополимера.

В случае белков не существует разработанных общих принципов конструирования лигандов, специфичных к определенным областям белка. Поэтому конструирование реагентов для аффинной модификации белков чаще всего основывается на знании их специфических лигандов. Таким образом получают производные или аналоги соответствующих субстратов для аффинной модификации каталитических центров ферментов. Также используют аналоги эффекторов для модификации регуляторных центров ферментов. Аналогии прозводные гормонов и нейромедиторов, снабженные реакционноспособными группами, Применяют для аффинного мечения соответствующих рецепторов, как, например, Реакционноепособные производные и аналоги АТФ, представленные ниже, которые были использованы для аффинной модификации АТФ синтазы (см. § 8.5):

115

Zi, Z2 = ?, Z3 = Na-<^Q V-NHCH2CH2C0-

W

Z4=PPP 3 '-0-^(2-нитроЧ-азидофенил)-Д-аланил]-АТР

Zi = Z2 = Za = H, Z4 = FS02-

5 '-?-фторсульфонил бензоил аденозил ?, = ?3 ?2 = ?3 = И, ?4 = РРР 2-азидо-АТФ ?, = ?, ?2 - ?3, ?3 = ?, ?4 = ??? 8-азидо-АТФ

Было найдено, что все эти соединения, первые три — при облучении УФ-светом, осуществляют аффинное мечение фермента из разных биологических объектов.

Для аффинной модификации ферментов используют тип реагентов, названных суицидными (реагенты-самоубийцы). Эти соединения сами по себе инертны при мягких условиях, но при воздействии фермента превращаются в реакционно-способный интермедиат, который может вызывать аффинную модификацию. Например, известно, что ?-гидроксиацил-СоА под действием фермента ?-гидроксидеканоил-АСР гидролазы (3-гидроксидеканоил-(ацилпереносящий белок]дегидратаза ЕС 4.2.1.60) превращается в ?,?-еноил-СоА в результате промежуточного отщепления протона ?-?+ по уравнению

R-CH2-CHOHCH2C(0)-ACP -» [R-CH2CH0HCH-C(0)-ACP]

-» R-CIi2CH=CHC(О)-АCP + ОН" (VII.28)

Сходные по структуре ?, ^-ацетиленовые тиоэфиры узнаются тем же ферментом. Но в этом случае отщепление протона приводит к образованию конъюгированно-го аллена, который легко алкилирует гистидиновый остаток, находящийся в активном центре фермента:

R-C=c-CH2-?(0)-SR' pl-C=C-CH-C(0)-SR']

, R-CH=C=CH-C(0)-SR' -» R-CH=C—CH2-C(0)-SR' (VII.29)

En ?

В отличие от белков для нуклеиновых кислот как минимум в двух случаях можно подобрать структуру, специфически взаимодействующую с произвольным участком нуклеиновой кислоты. Это, во-первых, участки однонитевых нуклеиновых кислот в областях, где они не образуют сложной пространственной структу-330

12

34

-GT79

ры, например шпилек или псевдоузлов. В этом случае такой участок будет узнаваться комплементарным олигоиуклеотидом или комплементарным участком нуклеиновой кислоты. Кроме того, если в составе двунитевой нуклеиновой кислоты имеется фрагмент, одна нить которого состоит только из пири-мидиновых нуклеотидов, а вторая соответственно только из пуриновых, то, как указывалось в § 3.7, можно подобрать соответствующий пиримидиновый олигонуклеотид, который может образовать тройной комплекс с" двуспиральным участком. Более того, после того как для нуклеиновых кислот были развиты методы селекции in vitro, открылась перспектива поиска для фрагментов нуклеиновых кислот со сложной пространственной структурой соответствующих аптамеров с достаточно высоким сродством к такой структуре.

Олигонуклеотиды или нуклеиновые кислоты, способные взаимодействовать с определенными, имеющими биологический смысл участками нуклеиновой кислоты, называют апти-смысловыми. Использование таких аитисмыс-лооых структур может привести к подавлению биологической функции соответствующей нуклеиновой кислоты-мишени, в связи с чем на них возлагаются большие надежды как на потенциальные противовирусные и противоопухолевые средства (в частности, в связи с проблемой СПИДа). Развитие таких подходов стало в последнее время одной из наиболее бурно развивающихся областей биотехнологии.

Одним из вариантов применения антисмыс-ловых подходов является аффинная модификация нуклеиновых кислот. Поскольку принципы формирования двуспиральных и трехспиральных структур в настоящее время хорошо известны, не представляет труда выбрать в олигонуклеотидах точки, несущественные для образования таких

структур. Например, присоединение реакционноспособных групп по концевому фосфату не должно приводить к нарушению взаимодействий между цепями, поскольку эти взаимодействия обусловлены в основном образованием водородных связей между гетероциклическими фрагментами. Более того, как видно из рис.

?

с

в

•G2»

Рис. 95. Электрофорегрнмма реакционных смесей после модификации ал-килирующими производными 303-звенного одноцепочечного фрагмента ДНК. Реакционная смесь обрабатывалась пиперидином для расщепления ДНК по точкам алкилирования:

/, И, 4 - продукты деградации фрагмента ДНК. полученные после алкилирования реагентами В, С и А; 3 - продукты деградации фрагмента ДНК по пуриновым нуклеотидам (маркер для определения положений расщепления)

331

26, введение заместителей, в том числе реакционноспособиых групп, в 5-положе-ние пиримидиновых гетероциклов не должно нарушать комплементарные взаимодействия в двуннтевых структурах.

Определение модифицированного остатка внутри биополимера с известной первичной структурой является конечной и наиболее трудоемкой стадией эксперимента. Обычным способом определения (локализации) модифицированного остатка в белке является первоначально ферментативное пли химическое расщепление биополимера на небольшие пептидные фрагменты, разделение их методом электрофореза, изоэлектрическим фокусированием или хроматографически и идентификация модифицированного пептида. Идентификацию провести достаточно легко, так как модифицированный пептид смещается относительно пемоди-фицированного в стандартной системе разделения. Далее может быть проведена процедура ступенчатой деградации по Эдману до тех пор, пока на одной из ступеней не образуется фенилтиогидантонновое производное с характеристикой, например хроматографической подвижностью, не свойственной фенилтиогидан-тоинам известных аминокислотных производных.

Этот подход не всегда приводит к желаемому результату из-за различных осложнений: многообразие модифицированных сайтов, обусловленное подвижностью первоначального комплекса белка с реагентом, приводящей к неоднозначной фиксации реагента на белке-мишени; нестабильность продукта модификации на стадии разделения или деградации но Эдману и др.

Локализация сайтов модификации в нуклеиновых кислотах обычно проводится методом, сходным с тем, который применяется при секвенировании ДИК методом Максама—Гилберта. Нуклеиновая кислота (мишень) метится 32Р по одному из концов. После аффинной модификации реакцноппоспособным производным антисмыслового олигонуклеотида мишень обрабатывают так, чтобы разрушить межнуклеотидную связь в модифицированном сайте. Па радиоавтографе, полученном после электрофоретнческого разделения, появляются полосы, соответствующие фрагментам мишени, расположенным между 32Р-мечепным концом и точкой расщепления. Положение полосы соответствует длине фрагмента и, следовательно, указывает на расстояние между точкой расщепления и меченым концом и тем самым указывает на положение модифицированного остатка. 13 качестве примера на рис. 95 представлены результаты аффинного алкнлмрованпя одпоцепочечиой ДНК, состоящей из 303 нуклеотидов. Для алкплпронаиня использовали следующие реагенты:

d(ApCpC|)CpTpCpTpTpCpCpCp)rA > CIIRC1 а C]RCll2Nllpcl(ApCpCpCprrpCpT])TpCpCi)Cp)]-A В

ClRClIo.MId(CpCpTpCpTi)Ti)CpCpCp)rA С

где RC1 — р-(Н-2-хлорэт11Л^-метиламино)фсиил — остаток, образующий высоко-реакционноспособный промежуточный этплепаммоипеный катион, который алки-лирует нуклеофильный центр мишени, преимущественно гуанины но ^-положению в соответствии со схемой

(VII.30)

где X — олигонуклеотид со спейсером, соединяющим RC1 с олигонуклеотидом. Участок мишени, по которому проходила модификация, имел структуру

-d(CpGpTpGpCpCpTpTpGpApApTpGpGpGpApApGpApGpGpGpTpCpApGpGpTpTpCpC)—

? ? ? ?

250 260 270 280

(номера указывают расположение нуклеотидных остатков во фрагменте ДНК).

Олигонуклеотиды, составляющие вышеуказанные реагенты, образуют комплементарные комплексы с нуклеотидами 261—274 (А и В) или 261—270 (С) мишени. Как видно из рис. 95, реагент А с реакционноспособной группой, присоединенной к аденозину, образующему Уотсон-Криковскую пару с основанием 261, алкилирует преимущественно G-258; реагент с группой, присоединенной к pdC, образующий пару с G-275, модифицирует главным образом этот же гуанин; реагент С с группой на pdC, взаимодействующей с G-270, большей часть алкилирует G-271 и G-272. Во всех этих трех случаях реакция протекает избирательно в той области, где находится реакционноспособиая группа.

При изучении субъеднничных белков и нуклеопротеидов аффинная модификация дает возможность понять, какие субъединицы участвуют в узнавании специфических лигандов. Эта проблема существенно проще, чем точная локализация точек модификации. Субъединицы как белков, так и нуклеиновых кислот обычно идентифицируются в соответствии с их положением на хроматограмме, электрофореграмме, при изоэлектрическом фокусировании в зависимости от выбранной системы деления. Присоединение метки обычно не изменяет существенно положение макромолекулы в таких системах. Следовательно, проблема заключается в том, чтобы обнаружить среди разделенных субъединиц ту, которая содержит введенную метку. Трудности возникают в тех случаях, когда в качестве лиганда, несущего реакционноспособную группу, берется полимер. Например, при изучении локализации транспортных РНК на рибосомах или на субъединицах аминоацил-тРНК-синтетаз возможно использование реакционноспособиых производных тРНК. Присоединение молекул, несущих большой отрицательный заряд, может привести к сильному изменению положения модифицированного белка в используемой си

страница 81
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2017)