Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

анноны I" иодируют остатки тирозина, превращая их в остатки

Дииодтирозина. Однако из шести остатков тирозина, входящих в состав фермеп-и находящихся в положениях 25, 73, 76, 92, 97 л 115 полппептидноп цепи, сУщественно модифицированными оказываются лини. Туг-73, Туг-76 и

Туг-115. Следовательно, именно они находятся на, поверхности молекулы рибонуклеазы, а остальные спрятаны внутри глобулы.

В нуклеиновых кислотах остатки, участвующие в образовании водородных связей с комплементарными гетероциклами, имеют, как правило, резко сниженную реакционную способность по сравнению со свободными гетероциклами. Например, реакция (VII.2} остатков аденина и цитозина с ¦ галогеиацетальдегидами проходит с участием экзоциклической аминогруппы и атома азота гетероцикла, которые являются непосредственными участниками уотсон-криковских взаимодействий (см. рис. 26). Поэтому в этенопроизводиые легко превращаются остатки, находящиеся в однонитевых участках, и существенно труднее — остатки, образующие двуспиральную структуру. Реагенты, различающие одно- и двунитевые структуры полинуклеотидов, широко используются для детального изучения вторичной структуры нуклеиновых кислот, в частности для выявления шпилечных структур. В табл. 7.7 приведены некоторые реагенты, широко применяемые для изучения пространственной структуры белков и нуклеиновых кислот методом химической модификации.

Метод нашел также широкое применение для выявления элементов пространственной организации комплексов биополимеров, в частности комплексов белков с нуклеиновыми кислотами. Если, например, фрагмент нуклеиновой кислоты принимает участие во взаимодействии с белком, то реагент, действующий на свободную нуклеиновую кислоту, не сможет атаковать фрагмент, экранированный молекулой белка. Поэтому на картине, отражающей распределение модифицированных фрагментов вдоль цепи нуклеиновой кислоты, на участке, закрытом бел-Ком, будет наблюдаться резко пониженный уровень модификации, своего рода отпечаток белковой молекулы. Этот метод получил название футприптинга, что означает <отпечаток ноги>.

Наряду с химической модификацией для тех же целей можно использовать ферменты, катализирующие гидролиз нуклеиновых кислот. Например, в экспериментах по футпринтпнгу комплексов ДНК с белками часто используют панкреатическую дезоксирибоиуклеазу (ДПКаза I), которая выделяется в пищеварительный тракт млекопитающих поджелудочной железой. Этот фермент катализирует гидролиз внутренних фосфодиэфпрных связей в двуиитевых и однонитевых ДНК. При кратковременной обработке ДНК этим ферментом, проведенной так, чтобы в среднем на каждую молекулу ДНК пришелся один разрыв, расщепление приводит к образованию фрагментов самой разнообразной длины, легко регистрируемых с помощью гель-электрофореза. При такой же обработке комплекса ДНК с белком расщепления в участках, экранированных белковой молекулой, не происходит и фрагменты соответствующей длины па электрофореграмме не обнаруживаются. На рис. 94 в качестве примера приведен результат исследования с помощью футпринтинга фрагмента ДНК с ферментом РНК-полимеразой (см. § 2.3). Отчетливо виден участок длиной около 40 нуклеотидов, закрываемый РНК-полимеразой от ДНКазы I. Он включает 15 нуклеотидных остатков, с которых происходит транскрипция (они обозначены положительными номерами), и предшествующий участок, с которым РНК-полимераза взаимодействует, чтобы зафиксироваться в положении, необходимом для начала процесса транскрипции (промотор, см. § 5.5).

Для изучения пространственной организации комплексов биополимеров шир°" ко применяют методы, основанные на сшивании компонентов ком-324

Таблица 7 7. Некоторые реат.ты, наиболее ши,х»ко применяемые для изучения „ро^ранствешюА структуры белков и нуклеиновых кислот

(Р - условное обозначение белковой молекулы)

Реагент

Имидоэфиры

формальдегид, альдегид

Ангидриды дикарбоновых кислот

? о дифицируемая

группа

Примеры некоторых реакций

?-Концевая о-амино-группа, ?-аминогруппа лизина

?-Концевая о-амино-группа, е-амино-группа лизина

?-Концевая, ?-аминогруппа, ?-аминогруп- 1 (p\_NHj + Jj па лизина j ctla^

Бутандион

nhhcl nhhcu (??-nh2+ С}Н,0-1!-СНз^Р-МН-2-СНз+ с,н,он

0-ннг+ нсно—-0-nh-ch,oh—СУ^ ^Z"»

0-nh1+ rcho^0-n-chrN-^0-nh-ch3r

рн V>

ch3

цитраиоио^ыи лигидрнл

0— nh—С— СН =С—COO-

9

-о—С—С—СИ,

Гуанидиногруппа аргинина

0—NH_C-

CHj'

Бром- или иодуксуснаЯ кислота

Диэтилпиро-карбонат

Иодирование

Нитрование

Sll-Группа цистеина, атом серы метиопина, атом азота имидазоль-иого кольца гистидина

Имидазолыюе кольцо гистидина

Остатки тирозина (замещение протона ароматического кольца тирозина)

Остатки тирозина

(?)—SH + BpCHjCOO" — (pj- s—ch2

COO"

\>c2h5

?·**··""**"·"" т*Оз

325

Реагент

Аминоэтили-рование

?-Этилмале-имид

Реагент Эл-лмана (DTNB) 5,5-дитиобис-(2- нитробен-

зоат)

Дициклогек-силкарбоди-имид

Гидросульфит натрия

OsQ4

Модифицируемая группа

SH-Группа цистеина

SH-Группа цистеина, а также остатки гисти-дина и лизина

Sll-Группа цистеина

Концевая карбоксильная группа и карбоксильные группы аспа-рагиновой и глутами-новой кислот

По двойным связям цитозина, урацила и тимина (Т < U < С)

Гидроксили рование двойных связей тимина, урацила, цитозина (Т > U > С)

1

Продолжение табл. 7.7

Примеры некоторых реакций

0>CHjSH + ?Н> — (?>-CHJ-S-CH2CH3NH.

эти мни и ии

^ и""^ »н7 ©-CHj-S-CH-cf" (p>-sh + 0,n-^^-s-s-^3-N02--

coo- тао-

.6

NH

?

л»

I --3

R

С ?,

СН3

o.ot. ??-

=Oaf

? ?

R

U СНз ? HN-^tCoH -?!!— R—NH-C—??2

326

Продолжение табл. 7.7

Реагент Модифицируемая группа

Примеры некоторых реакций

Диметил- I Гуанин (N7, N1), аде-сульфат нин (N1, > N7) > N3, ци-

тозин (N3)

Гидразин I Урацил, тимин, цитозин

Диэтилпиро- I Аденин, гуанин карбонат

Метиловый Урацил, цитозин эфир гидрокси-) ламина

о>Дикарбо- Гуанин (? I) и экзо-нильные соеди- [циклическая амино-нения I группа

, о ЧНз

?? Т|

R

,, - - . 1 j" + RNHNHj+ NH,—CO—NH,

NH, i°°C'H'

I4HJ

R

nh,0chs

NHOCH,

hAV ph7-°"7'5 ???

2 1 ? q

Хлор- или бромацет альдегид

Аденин, цитозин

R

X = ? - глиоксаль

X = СН3 - иировиноградный альдегид

X = СН3СНОС2Н5;- З-этоксибутанол-2-алем-)

??2--N

ЧА/ рн" ЧА/

? R

327

Продолжение табл. 7!

Реагент

Модифицируемая

группа

Примеры некоторых реакций

N-AnKwi-N-HH-трозоыочевина

Межнуклеотидный фосфат, гуанин, аде-нин, цитозин N7(C) > >N1(A)>N3(C)

•Сг-Н,С

? он ?=?-?-o-H2c ?

о он

O^CHjjCjH,)

•0-н,с

1 il

?—?— С—NHj

? 6н ?=?-?—?

-сн,0

0 0? I

ШВ "JUJL

плекса с помощью бифункциональных реагентов. Эти реагенты содержат в своем составе две одинаковые или различные группы, способные присоединяться к каким-либо остаткам биополимеров. Например, при обработке рибосом диэтилсуберимидатом, реагентом, содержащим две имидоэфирные группы, атакующие ?-амино-группы остатков лизина, белки, находящиеся на достаточно близком расстоянии друг от друга, могут оказаться ковалентно связанными (сшитыми). Определяя, какие именно пары белков рибосом оказались сшитыми в результате такой обработки, можно получить ценную информацию о пространственной организации рибосомы. Если бифункциональный реагент может взаимодействовать как с белками, так и с нуклеиновыми кислотами, то с его помощью можно определить, какие именно белки непосредственно связаны с нуклеиновой кислотой в нуклеопротеидах. Так, обрабатывая рибосомы реагентом т»анс-[1Ч(1Ша)2(!1 _>], в котором ионы С1", координированные ионом Pt2+, могут быть замещены на нук-леофильные группы белка (SCH3 — группа метионнпа, S1I — группа цистеина, пмидазольное кольцо гистидина и др.) и азотсодержащих гетероциклов (в первую очередь N7 остатков гуанина), можно определить, какие именно белки в составе рибосомы непосредственно контактируют с рибосомпой РНК.

Рис. 94. Злектрофореграмма фрагмента двунитевой ДНК, меченного -Р по 5 '-концу одной из нитей (матричной):

а - исходный фрагмент ДНК, обработанный ДНКазой I; б - фрагмент ДНК. обработанный ДНКазой I в присутствии РНК-полимеразы (данные А. Спасского)

7.17. АФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ БИОПОЛИМЕРОВ

Как уже неоднократно отмечалось, фундаментальным свойством белков и нуклеиновых кислот является их способность узнавать определенные низкомолекулярные соединения или другие прлимеры. Результатом узнавания является образование стабильных комплексов с этими лигандами. Обычно это не приводит к изменениям химической структуры биополимера и позволяет неоднократно использовать эти же молекулы биополимера, если это узнавание влечет за собой какие-либо биологические последствия. В то же время отсутствие каких-либо химических последствий означает, как правило, отсутствие каких-либо следов пребывания биополимера в виде комплекса с соответствующим лигандом. Между тем во многих случаях желательно, чтобы такой след остался для определения области биополимера, принимавшей участие в узнавании. В некоторых случаях желательно сделать это узнавание необратимым для того, чтобы повредить биополимер с соответствующими биологическими последствиями. Обе эти проблемы решаются благодаря подходу, известному как аффинная модификация (или аффинное мечение).

Узнавание основывается на взаимодействии нескольких центров биополимера со специфичным лигандом. Тем не менее в большинстве случаев в лиганде могут быть найдены некоторые центры, которые либо вообще не участвуют в образовании комплекса, либо их изменение существенно не влияет на стабильность комплекса. Эти центры могут быть использованы для присоединения реакционно-способных остатков к лигандам без существенного изменения способности образовывать комплекс с биополимером. . Внутри такого комплекса реакционно-способная группировка может оказаться сближенной с определенным остатком биополимера и в дальнейшем ковалентно связаться с реагентом. Следовательно, химическая модификация происходит либо в сайте узнавания, либо в близлежащей области биополимера. Так как эта реакция протекает вследствие сродства (афф

страница 80
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.04.2017)