Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

как используемые для амплификации нраймеры отпо-а другой к акцепторному фрагменту, то ДНК-копия олигонуклеотида амплификации не

РНК-лигазной ак-

сятся один к донорному непрореагировавшего акцепторного

подвергается. Таким способом проводится вторая селекция. Для продолжения процесса нужно провести транскрипцию той части амплпфпката, который соответствует донорной РНК. Для этого проводится повторная амплификация с прай-мерами, соответствующими концам фрагмента, подлежащего транскрипции, причем праймер, расположенный в области стартовой точки транскрипции, снабжен промоторной последовательностью для Т7 РИК-полпмеразы (рис. 87, о). После этой повторной амплификации проводится транскрипция и восстанавливается донорный фрагмент, но уже прошедший цикл селекции, т.е. теоретически содержащий только каталитически активный материал, а практически существенно обогащенный по каталитически активным последовательностям. Это дает возможность провести еще один или несколько циклов селекции. В описываемой работе удалось получить рибозим, который катализировал реакцию лигпроваиия с константой скорости 8 ч"1, при том что самопроизвольная реакция лигпроваиия в этих условиях характеризуется константой скорости 3-10"'5 ч"1.

Приведенные примеры наглядно демонстрируют, что метод молекулярной

308

селекции нуклеиновых кислот уже в своем сегодняшнем состоянии позволяет осуществлять целенаправленный поиск среди неисчерпаемого многообразия нуклеиновых кислот структур, способных к связыванию определенных лигандов и рибозимов с новыми типами каталитической активности. Скорее всего это лишь первые шаги нового направления в биохимической технологии.

7.13. РЕ11ТГЕ1ЮСТРУКТУРИЫЙ АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ

Единственным методом, который позволяет определить пространственные координаты большинства атомов биополимера (как правило, всех, кроме атомов водорода), является рентгеноструктурный анализ. Он применим к тем биополимерам, которые могут быть получены в виде кристаллов достаточно большого размера, по крайней мере несколько десятых долей миллиметра. Для биополимеров, имеющих вытянутую периодическую пространственную структуру, например для двунитевых спиральных структур нуклеиновых кислот, геометрические параметры, описывающие основные элементы структуры, могут быть получены исследованием дифракции рентгеновских лучей иа ориентированных нитях этих биополимеров. Именно такие данные, полученные для нитей ДНК английскими учеными Уилкинсоном и Розалинд Франклин, позволили Уотсопу ? Крику предложить пространственную структуру ДНК в виде двойной спирали. Возможность получения белка, нуклеиновой кислоты или их комплекса в виде кристалла достаточно высокого качества является основным ограничением на пути исследования пространственной структуры биополимеров. Одним из факторов, осложняющих кристаллизацию, является неизбежное возникновение конвекционных токов. В связи с этим определенные надежды па улучшение процедур кристаллизации возлагаются на выращивание кристаллов в условиях невесомости па орбитальных космических станциях.

Методы определения координат атомов в кристаллической решетке с помощью реитгеноструктурного анализа хорошо отработаны и продолжают совершенствоваться. В основе их лежит изучение картины дифракции рентгеновских лучей на кристаллической решетке. Пучок рентгеновского излучения рассеивается на атомах решетки, причем в результате интерференции лучей, рассеянных в определенном направлении от разных областей решетки, происходит практически полное гашение рассеянного пучка. Взаимное усиление происходит лишь в некоторых определенных направлениях, удовлетворяющих уравнению Лауэ:

7?? = 2???, 3? = 2???·, Зс = 2я7, (7.7)

где 3 = (s0 — s) — разность волновых векторов падающего на кристалл и рассеянного лучей; а, о\ с — векторы элементарной ячейки кристалла (рис. 88); л, к, I — целые числа. По определению, модуль волнового вектора равен 2тг/А и, следовательно, модуль вектора 3 может принимать любые значения, не превышающие 4тг/А. Рассеянное излучение может быть зарегистрировано либо с помощью рентгеновской пленки, либо с помощью специальных счетчиков рентгеновского излучения. На пленке получается типичная картина (рис. 89), состоящая из

309

;—1—'-Г

-о ?

Рис. 88. Схема рассеяния рентгеновского иату-чения от элементарной ячейки кристаллической

решетки с векторами сторон а, 7), с:

/ - направление падающего пучка; 2 - направление

рассеянного пучка; л0 и .s - волновые векторы падающего и рассеянного пучков

I

Рис. 89. Фотография рассеянного в одном из направлений рентгеновского излучения, полученная на кристалле эндонуклеазы рестрикции EcoRI (данные Юнга, Модрича, Бэта и Джея)

системы точек, соответствующих по направлению условиям уравнения (7.7). Расположение этих точек дает возможность с помощью уравнения .(7.7) определить

векторы а, %, с, т.е. тип и параметры кристаллической решетки. Меняя направление падающего излучения (практически это делается не изменением положения источника рентгеновского излучения, а поворотом кристалла), можно получить

сведения о рассеянных пучках для всевозможных векторов 5. Измеряемой величиной для каждого пучка является интенсивность рассеянного излучения, либо определяемая по почернению пленки, либо измеряемая счетчиком. В результате таких измерений интенсивность получается в виде функции в пространстве вектора 3, т.е. в виде функции трех координат этого вектора.

Основное рассеяние рентгеновских лучей происходит в результате их взаимодействия с внутренними нековалентными электронами атомов вещества. Поэтому интенсивность рассеяния от каждого участка элементарной ячейки определяется величиной электронной плотности в этом участке элементарной ячейки кристалла, которая является функцией координат и может быть записана как р(г), где г— радиус-вектор точки, задаваемый ее декартовыми координатами. В этом случае

интенсивность рассеяния в направлении, задаваемом вектором 3, оказывается величиной, пропорциональной квадрату модуля фактора рассеяния, который в комплексной форме определяется как

?

(7.81

где интеграл берется по объему кристалла. Это соотношение связывает функцй! F0), модуль которой J/^S)! находят экспериментально из картины дифракци

рентгеновских лучей на кристалле, с искомой функцией р(г), дающей положение сгустков электронной плотности в элементарной ячейке кристалла, а тем самым каждого атома, кроме атомов Н, не имеющих внутренних электронов.

Как видно из (7.8), функция F0) получается преобразованием Фурье функции

р(г) и, следовательно, последняя может быть найдена из F{$) обратным преобразованием Фурье:

rfr)= f F0)e,SrdVs, (7.9)

где интегрирование ведется по всему объему пространства вектора 3, т.е. в пределах сферы радиуса 4тг/А. Поскольку функция f(3) в общем случае является комплексной, ее можно записать как произведение модуля находимого из

эксперимента, и фазового множителя е**^. Так как функция F(3) дискретна, т.е. отлична от нуля лишь в точках, удовлетворяющих уравнениям (7.8), то (7.9) можно записать в виде

?(?) = ??? ^У5)е2'''^/а+ку/Ь+12/с) (? ш)

h к I

Наиболее сложным моментом при нахождении координат атомов в элементарной ячейке является определение фазовых множителей, соответствующих каждому отраженному от решетки пучку. Эта задача решается по-разному для низкомолекулярных веществ и для биополимеров.

Один из широко используемых для низкомолекулярных соединений приемов состоит в применении функции Паттерсона:

рО) = ? p(r)p(? + 1)dK (7.11)

?

Нетрудно убедиться, что функция ?[?) отлична от нуля, только если одновременно р(г) и р(г + ?) отличны от нуля, т.е. если соответствует вектору, соединяющему два рассеивающих рентгеновское излучение атома ячейки. Вычисление функции Паттерсона проводится с помощью выражения

^) = ??? \F0)\2eSZdV (7.12)

и не требует знания фаз. При небольшом числе атомов знание векторов, соединяющих пары атомов, достаточно для построения пространственной модели молекул, из которых состоит элементарная ячейка.

В рентгеноструктурном анализе биополимеров решающую роль сыграл метод изоморфного замещения. Велки и нуклеиновые кислоты не заполняют целиком элементарную ячейку, в ней всегда имеется значительное число молекул растворителя. Это дает возможность в ряде случаев заменить несколько молекул растворителя в кристалле биополимера на вещества, содержащие атомы тяжелых металлов [например, ввести анноны n-CHIgCell^SOj или AuCl^, катионы Hg(NII3)* и т.п.],

не нарушая конформации биополимера (изоморфно). Расположение рассеянных пучков рентгеновских лучей для такого изоморфно замещенного кристалла будет совпадать с расположением рефлексов от незамещенных кристаллов, так как параметры ячейки, характеризуемые векторами а, %, с, не изменяются, но значения интенсивности каждого рассеянного пучка претерпевают определенные изменения. Поэтому для каждого пучка определяются две величины, соответствующие кристаллу незамещенного

биополимера, | Fn0) | и кристаллу биополимера, в котором проведено

замещение тяжелым металлом |/пм(3')|-Кроме того, можно определить положение тяжелых атомов в ячейках содержащего тяжелый атом кристалла, вычислив для него функцию Паттерсона. У этой функции на фоне бесчисленного множества максимумов должны резко

выделяться максимумы, соответствующие векторам г, соединяющим пары тяжелых атомов ячейки. '

Зная положение тяжелых атомов, можно рассчитать комплексную функцию

^м(З), характеризующую отдельно рассеяние от этих атомов. Так как факторы

рассеяния аддитивны, то FnM(5) равно сумме Fn0) и FM(5). В комплексной плоскости эти три величины, представленные в виде векторов, образуют треугольник,

у которого известны основание FM($) и размеры двух других сторон. Как видно из рис. 90, на этом основании можно построить всего два треугольника, отвечающих этому требованию, один из которых соответствует комплексным величинам

•Рпм(З) и Fn(§). Неоднозначность снимается, если аналогичные измерения провести еще для одного- независимого изоморфно-замещенного крис

страница 76
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.10.2017)