Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

те из них, которые производят продукт- искомого гена. Отбор может быть проведен с помощью им-мунохимических методов. Если имеется информация о первичной структуре какого-либо достаточно протяженного участка гена, то отбор клонов можно проводить с пользуясь соответствующими синтетическими олигонуклеотидными зондами.

Методы генетической инженерии стали важным инструментом биохимических исследований. В частности, они не только открыли возможность получения значительных количеств ранее мало доступных белков, в том числе эукариотических, но и возможность внесения направленных точечных изменений в первичную структуру белков, т.е. замены одного определенного аминокислотного остатка на любой другой произвольно выбранный аминокислотный остаток (в пределах 20 аминокислот, из которых могут строиться полипептидные цепи при трансляции). Это достигается путем замены соответствующего кодона в гене, программирующем исследуемый белок Такая процедура называется сайт-специфичным мутагенезом.

Одна из наиболее употребляемых схем такого мутагенеза приведена на рис. 85. С этой целью исходный ген встраивают в двунитевую репликативную форму ДНК фага ?13, зрелые частицы которого содержат однонитевую кольцевую молекулу ДНК (плюс-цепь, см. § 5.7). Введение полученной рекомбинантной ДНК в бактериальные клетки приводит к накоплению частиц бактериофага, содержащих однонитевую рекомбинантную ДНК, из которых ее можно выделить и использовать в качестве матрицы для ДНК-полимеразы. Для репликации используют специально сконструированный праймер, который соответствует участку встроенного гена, содержащему кодирующий элемент заменяемой аминокислоты. При этом по обе стороны от этого тринуклеотнда праймер полностью комплементарен рекомбинантной ДНК, а в пределах этого тринуклеотнда заменен таким образом, чтобы в образующейся при репликации минус-цепи образовалась запла-

Рис. 85. Схема сайт-специфичного мутагенеза:

1 - встраивание гена в двунитевую репликативную форму ДНК фага ?13 (M13RF1); 2 - образование зрелых частиц фага, содержащих однонитевую кольцевую молекулу ДНК (плюс-цепв); 3 - синтез минус-цепи с использованием изме-. ненного праймера, содержащего кодирующий элемент заменяемой аминокислоты; 4 - образование замкнутой репликативной формы, содержащей запланированную мутацию; 5 -введение ее в бактериальную клетку и производство плюс-цепей, несущих мутацию в выбранном сайте

помощью метода молекулярной гибридизации,

нированная мутация. После превращения комплекса ДНК-праймер в замкнутую двунитевую структуру последнюю снова вводят в бактериальные клетки, в которых начинается производство плюс-цепей, несущих мутацию в выбранном участке (сайте), а затем и формирование мутантных частиц зрелого бактериофага.

Такие направленные изменения в белках (белковая инженерия) стали важным инструментом для установления роли отдельных аминокислотных остатков в формировании пространственной структуры белка и выполнении им своих функций. В качестве примера можно привести результаты исследования роли остатка тирозина-248, входящего в активный центр карбоксипептидазы А (см. § 6.1). После установления пространственной структуры этого фермента с помощью рентгеноструктурного анализа высказывалась точка зрения, что гидроксигруппа этого остатка принимает участие в подаче протона на атом азота гидролизуемой пептидной связи и одновременно в удалении протона от молекулы атакующей воды. Однако, когда методом сайт-специфичного мутагенеза была осуществлена замена этого остатка тирозина на фенилаланин, оказалось, что каталитические свойства фермента практически не изменились. Таким образом, роль гидроксигруппы тирозина-248 в катализе не подтвердилась.

Встраивание генов неизвестного строения в ДНК фага М13 приводит к получению ДНК, у которой наряду с хорошо известной последовательностью имеется фрагмент неустановленной структуры. Такая конструкция очень удобна для установления первичной структуры встроенного фрагмента методом Сэнгера (см. § 7.8). Этот подход становится одним из основных для подготовки фрагментов ДНК самого разнообразного происхождения к заключительной фазе секвенирования.

7.12. МОЛЕКУЛЯРНАЯ СЕЛЕКЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Генетическая инженерия открыла новые возможности перед учеными и биотехнологами в значительной мере в результате применения селекционных методов, т.е. отбора клонов микроорганизмов с определенными свойствами. Появление метода амплификации нуклеиновых кислот в последнее время привело к рождению подходов, основанных на селекции нуклеиновых кислот in vitro, т.е. на молекулярном уровне (молекулярная селекция нуклеиновых кислот). Действительно, если имеется способ среди множества нуклеиновых кислот отобрать такие, которые обладают определенными свойствами, то далее возможно размножить такие нуклеиновые кислоты с помощью амплификации (см. § 7.5) и далее, если требуется, повторить селекцию еще один или несколько раз, Таким образом, все, что требуется для отбора нуклеиновых кислот с заданными свойствами, — это иметь исходный материал для селекции и способ его отделения от остальной массы материала.

Что касается материала для селекции, то получение огромного многообразия нуклеиновых кислот в виде смеси не представляет труда. Для этого достаточно провести синтез, используя на некотором числе этапов смесь всех четырех мономеров вместо индивидуальных мономеров. Это легко сделать па автоматах для олигонуклеотидного синтеза. Этот процесс часто называют рандомизованным синтезом (от англ. random — беспорядочный). Нетрудно оценить, что в 1 мкмоль смеси, содержащей 40-мерные рандомизовапные последовательности, будет Л40 = = 1024 различных последовательностей, т.е. скорее всего вообще не будет двух 306

одинаковых молекул, поскольку 1 мкмоль содержит всего порядка 1018 молекул. В простейшем случае, чтобы в дальнейшем без всяких специальных ухищрений проводить амплификацию, желательно, чтобы рандомизованные последовательности находились между двумя участками с определенной последовательностью, которые после селекции могли бы быть использованы для прай-меров.

Проще всего представить себе селекцию ДНК на способность связываться с определенными лиган-дами. Для этого достаточно иммобилизовать лиганд на нерастворимом носителе, например на агарозе, и пропускать полученную смесь большого числа разнообразных нуклеиновых кислот через колонку. Задержанный на колонке материал после злюции может быть амплифицирован и подвергнут следующему циклу селекции.

Метод легко переносится на селекцию молекул РНК (рис. 86). В этом случае на одной из сторон подвергаемой селекции молекулы должен помимо праймера находиться промотор для РНК-полимеразы, например фермента фага Т7. Получаемые ДНК или РНК с заданными свойствами называют аптамерами. Повышенный интерес к РНК-аптамерам в значительной степени связан с попытками создать рибознмы с новыми несвойственными природным рнбознмам каталитическими характеристиками. Уже описаны РНК-аптамеры для некоторых аминокислот, для аденозина и- адениловых нуклеотидов, включая АТФ, для коферментов и кофакторов, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях — пикотнпамидпых и флавиновых.

Одно из более сложных применений молекулярной селекции нуклеиновых кислот связано с попытками создать па этой основе рибознмы с новыми каталитическими функциями. С этой целью необходимо создать новые методы селекции. Как уже говорилось в § 6.4, открытие рибозимов вызвало повышенный интерес к возможности участия рибозимов на первых этапах эволюции. Для этой цели необходимы рибознмы с синтетическими функциями. Ниже приводится пример получения с помощью молекулярной селекции нуклеиновых кислот фермента, катализирующего реакцию соединения двух олигорнбопуклеотидов, один из которых (донорный) несет на 5'-конце трпфосфатную группу, с помощью которой с отщеплением ппрофосфата осуществляется образование новой меж нуклеотидной связи с 3 '-Oil-группой акцепторного олигонуклеотида. Эта реакция по своему типу идентична реакции элонгации полинуклеотидиой цепи, в ходе которой осуществляется перенос нуклеотидного остатка от нуклеозпд-5 '^грифосфата на 3 '-ОН-группу растущей полинуклеотидиой цепи. Схема селекции представлена на рис. 87. Для большей эффективности этого процесса трифосфатпая группа и 3'-ОН-группа донора должны быть сближены. Это можно сделать создав конструкцию (рис. 87, а), в которой эти дне группы оказываются комплементарными соседним нуклеотидам стебля в шпилечной структуре. На 5'-конце акцепторного

3 2 _1

Рис. 86. Схема селекции для получения РНК со сродством к небольшим лигандам:

/ - участок для амплификации ДНК соответствующей продукту синтеза; 2 - рандомизованный фрагмент; 3 - участок для амплификации ДНК; 4 - аффинная колонка с иммобилизованным ли-гандом; а - афинная хроматография и элюция; б - обратная транскрипция; в - амплификация; ? - транскрипция

Рис. 87. Селекции рибозима тивностью:

/ - 5 '-концевой фрагмент донорной РНК: 2 - рандоми-зованный фрагмент РНК: ? - акцепторный олигонуклеотид; 4 — аффинная колонка с иммобилизованным олпго-нуклеотидом, комплементарным 5 -концу акцепторного олигонуклеотида: .5 — праймер для амплификации ДНК, соответствующий продукту синтеза; 6 — праймер для амплификации участка ДНК,кодирующего донорный рибо-олигонуклеотид, снабженный промотором для Т7 РНК-полимеразы

олигонуклеотида имеется последовательность, с помощью которой он может сорбироваться на аффинной колонке, содержащей комплементарный этой последовательности олигонуклеотид, иммобилизованный иа ага-розе.

При смешении обоих ол 11 го 11 у к л ео'п ? д ов небол ы ? ая часть допориого материала, обладающая каталитической активностью, соединяется с акцепторным олигонуклеоти-дом (рис. 87, б). Образовавшийся продукт может быть сорбирован иа аффинной колонке. При этом, естественно, сорбируется п пепро-реагпровапший акцепторный олигонуклеотид (рис. 87,о). После десорбции проводится обратная транскрипция отобранной РНК и полученная ДМ К, соответствующая продукту синтеза, амплифи-цпруется (рис. 87, г). Так

страница 75
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.08.2017)