Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

риптазы синтез комплементарной ДНК (сокращенно к ДНК.) и перевести ее в двунитевую структуру с помощью ДНК-полпморазы. Можно, наконец, вырезать желаемый ген непосредственно из ДНК того объекта, белок которого собираются продуцировать. Два последних подхода пе дают сразу же индивидуального гена и требуют предварительного отбора из сложной смеси кДПК или фрагментов хромосомной ДНК. Эта проблема решается уяЛ? па уровне клеток микроорганизмов, в которые введены новые наследственные программы, и пути ее решения будут изложены несколько ниже.

После того как исследователь получит материал, содержащий интересующий его ген, он должен ввести его в состав специальных молекул ДИК, которые способны проникать в клетки и автономно размножаться в составе этих клеток. Такие молекулы ДНК получили название векторных молекул или просто векторов. В качестве векторов используют чаще всего две группы объектов: плазмиды и вирусы, в том числе бактериофаги. Число векторов, используемых в генетической инженерии, весьма велико, и ознакомиться с ними можно в специальных руководствах по генетической инженерии. Основные элементы используемой в генетической инженерии методологии изложены нами па примере широко используемой плазмиды рН1Ш2, размножающейся в клетках E.coli. Эта плазмида придает бактериальным клеткам устойчивость к двум антибиотикам — ампициллину и тетрациклину, поскольку содержит гены, программирующие специальные ферменты, которые катализируют превращение этих антибиотиков в нетоксичные для клетки вещества. Эта устойчивость играет важную роль при последующих генно-инженерных манипуляциях.

Чтобы встроить ген в кольцевую плазмиду, последнюю превращают в линейную двунитевую ДНК обработкой какой-либо эпдопуклеазоп рестрикции (см. § 7.8), специфичной к единственному участку плазмиды и катализирующей ее расщепление в одном из генов устойчивости к антибиотикам. 13 случае плазмиды PBR322 это можно, например, осуществить с помощью эндонуклеазы l'stl, специфичной к последовательности —il(pCpTpGpCpApG)— и катализирующей гидролиз фосфодиэфирной связи между остатками дезоксиадепплата и дезоксигуапилата

301

HO-CCCCC

CTGCA-OH

ОН

CTGCAGGGGGp CCCCC-

i

ОН

»GGGGGACGTcf\ ОН

он рн .C-TGCApG—-с- TGCApG-^

/WgT-C-GpAGCT-

ОН ОН

IS

ДНК-лолммераэа I

дНТФ

? |ДНК-Лиг,за

CTGCAG-"ACGTC-

-CTGCAG—t •GACGTC-C\

J

Рис 84. Схем, встраивания гена в кольцевую плазмиду:

' : ДНК с „и конвдми:

иеьой структуры с двумя „иками; я- обр" J?i ^раиьаемого гена в виде копь-4 - образование липких концов с ??^?????"™" КОМП" ДНК-пига.ой: У гена в присутствии дЦТФ и ? ппТмГноЛшк ^"^мукпеотидилтрансферазы

=с=ЯЕ=г ~~ -=?

ходГТ^^вГоГз: 5<-К™ ФОСфата' Э™ ~ие проис-линейная ДНК ^меет так назывяе '4И'ЮСТЬ к -пицмллниу. Образующаяся сторон Дв^ит^ой с;^к упы опГЫв """? К0НЦЫ' ТС- "купающие с обеих концам мо^ет присед «Гея ZTZ ^™"™ d^C»C^ По этим 302 Динигься олиго- или полинуклеотид, имеющий комплемен-

тарную последовательность нуклеотидов, которая в данном случае (это вообще типично для эидонуклеаз рестрикции) индептична липким концам плазмидной ДНК. Такую последовательность может содержать на концах встраиваемый двунитевой ген, если он получен путем химпко-фермсптатнвного синтеза, в ходе которого предусмотрены такие конструкции, млн двунитевой ген, вырезанный из молекулы ДНК с помощью той же эндонуклеазы I'stl. 13 этом случае возможно образование комплекса линейной плазмидной ДНК п встраиваемого гена в виде кольцевой структуры с двумя нпкамп (рис. 84), который при последующей обработке ДНК-лигазой в присутствии донора адепплата (см. jj 5.4) превращается в замкнутую двунитевую ДНК, содержащую встроенный ген.

Если у гена липкие концы нужного строения отсутствуют, то можно их искусственно создать. Удобным для этой цели ферментом является терминальная дезоксинуклеотидил траисфераза (выделяемая из внлочковой железы телят), которая катализирует безматричный перепое дезокеппуклеотндпых остатков от дезоксинуклеозид-5'^грифосфатов на 3'-концевую гидроксигруппу олиго- или полидезоксинуклеотидов. Как видно из рис. 84, такие концы можно получить, обрабатывая плазмндную ДНК трансферазон в присутствии дГТФ, а встраиваемый ген — тем же ферментом в присутствии дЦТФ. Слипание гена и плазмиды происходит за счет комплементарных олмгодезокспгуапиловых и олмгодезоксн-цитидиловых последовательностей, причем образуется кольцевая структура с брешами в каждой нити. Эти бреши могут быть застроены с помощью ДНК-полимеразы I в присутствии смеем всех четырех дНТФ. После этого пики ликвидируются с помощью ДНК-лигазы.

Образование кольцевой плазмиды со встроенным геном в ходе описанных обработок отнюдь не является количественной процедурой. Часть линейных молекул может вообще не образовать никаких кольцевых структур, другая часть --образовать структуры без встраивания дополнительного гена; могут также образоваться комплексы двух или более нлазмидпых ДИК и т.д. Поэтому необходим отбор плазмпд, содержащих дополнительный ген. Этот отбор проводится в ходе процедуры, известной под названием клонирования. Этой процедуре предшествует введение полученной смеси ДНК' в бактериальные клетки, которые сделаны проницаемыми для двупитевых ДНК путем специальной обработки, например растворами солей кальция или рубидия. 13 результате получается гетерогенная популяция бактериальных клеток, некоторая, сравнительно небольшая часть которых содержит плазмиды со встроенным гоном. Задачей клонирования является отбор именно этих клеток.

Суть клонирования состоит в том, что из каждой клетки по отдельности выращивается популяция клеток, именуемая клопом. В отличие от исходной популяции каждый клон гомогенен, т.о. либо все его клетки содержат плазмиду со встроенным геном, либо все ее не содержат. Техника клонирования достаточно разнообразна, и ниже будет излагаться одна из типовых схем.

Очевидно, что в рассматриваемом случае нужно отобрать те клетки, в которые проникли плазмиды со встроенным геном. Такие клетки должны сохранить способность расти на среде, содержащей тетрациклин, ген которого остался неповрежденным, и утерять способность расти на среде, содержащей ампициллин, поскольку его ген испорчен введенной вставкой. Поэтому разбавленную суспензию клеток, обработанную описанной смесью ДНК, наносят па плоские чашки, в которые залит агаровый гель, содержащий все компоненты, необходимые для

размножения бактерий, и антибиотик тетрациклин. Из каждой клетки, содержащей плазмиду, на такой среде вырастает популяция клеток, именуемая клоном. Из клеток, лишенных плазмиды, на этой среде клоны не вырастут, так как они лишены защитного механизма для обезвреживания тетрациклина. Следующей задачей является отбор тех клонов, в которые произошла встройка гена. Для этого каждый клон проверяют на способность расти па среде, содержащей ампициллин, и отбирают те клоны, которые на такой среде не растут, т.е. у которых ген, ответственный за устойчивость к этому антибиотику, отсутствует. Это и есть клоны, у которых в пределах гена устойчивости к ампициллину произошла встройка дополнительного генетического материала. После отбора клонов со встроенным геном можно размножить клетки этого клопа в достаточном количестве, выделить из них плазмидпую ДИК и с помощью той же рестриктазы <выре-зать> размноженный ген.

Если ген нужен для производства программируемого им белка, то с помощью аналогичных приемов его встраивают в специальным образом сконструированные плазмиды, в которых ген примыкает к эффективно работающему промотору РНК-полимеразы. При введении таких плазмнд в соответствующие клетки последние начнут интенсивно нарабатывать информационную РНК, соответствующую этому гену, а с ее помощью и конечный продукт гена — белок. Векторы, используемые для этой цели, называют экспрессирующилги. Отбор клеток, которые экспрессируют встроенный ген, лучше всего вести непосредственно по накоплению продукта экспрессии в клонах, например используя радпоиммуноанализ или иммуноферментный анализ с мечеными антителами к продуцируемому геном белку.

Нередко возникает задача ввести ген в клетки эукариот, например в дрожжевые клетки, в которых могут нарабатываться белки, прошедшие после их образования необходимые стадии модификации, несвойственные прокариотическим клеткам. Для этой цели используют специальные, так называемые челночные, векторы, которые могут автономно размножаться как в прокарпотическнх, так и в эукариотических клетках, например в E.coli и дрожжах. В эукариотические клетки плазмиды вводят иа заключительных стадиях, поскольку многие предварительные этапы клонирования существенно проще проводить в клетках прокариот.

Главным условием автономной репликации является наличие в составе плазмиды участков ori, т.е. области начала репликации. Эти участки резко отличаются у прокариот и эукариот. Поэтому челночный вектор должен содержать два таких участка.

Если гены получаются в виде фрагментов хромосомной ДНК или в виде комплементарной ДНК, то в подавляющем большинстве случаев первоначально в руках исследователя оказывается чрезвычайно сложная смесь. Так, общепринятый метод выделения информационных РНК эукариот основан иа наличии иа 3'-конце этих РНК полиадениловых фрагментов (см. § 5.6). Такие мРНК задерживаются на аффинных сорбентах, содержащих иммобилизованную полиуридиловую кислоту или синтетические олиготимидилаты, в результате комплементарных взаимодействий последних с поли(А) участками мРНК. При осуществлении обратной транскрипции получается смесь комплементарных ДНК (кДНК), соответствующих всему набору мРИК, выделенному из исходной биомассы. После создания ? полученных кДНК липких концов осуществляется их встраивание Щ_

какой-либо вектор, например в плазмиду pBR.322. В итоге получается сложная смесь векторых молекул, содержащих весь набор кДНК. Такие смеси в генетической инженерии называют библиотеками, в данном случае библиотекой кДНК. Для нахождения нужного гена в такой библиотеке также используется процедура клонирования. В этом случае после выращивания клонов отбирают

страница 74
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2017)