Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

тве носителя используют тлавным образом силикагель или пористое стекло. Их обрабатывают так, чтобы ввести аминогруппы, которые в дальнейшем

Рис. 82. Схема твердофазного синтеза дезоксирибоолигонуклеотидов фосфита.мидным методом:

нуклеозиды; Nuc, - нуклеозиды, защищенные по NH2-rpynnaM гетероциклов; dmt - димето-

кситритильная группа. После каждого цикла / возрастает на единицу, пока не достигнет желаемого значения i=n. Стадия кэширования проводится для превращения следов непрореагировавших 5'-0Н-групп в ацетоксигруппы. После очистки целевого продукта хроматографией диметокситритильная группа удаляется

907

HO-

IK

^ ДНК-лигам (+ АТФ или NAD*)

I-II

МП

i i

III

-OH

HO-

11111111111,41

Ш

HO.

HOP

^ ДНК-. С 1-И

HO ? v)

( + АТФ или NAD*)

! ! I I !

¦OH

-OH

? IV - III - V

Рис. 83. Схема ступенчатой сборки фрагмента двуспиральной ДНК из олигонук-леотидов I, II, 111, IV, V с помощью ДНК-лигазы. Вертикальными линиями показаны комплементарные взаимодействия

взаимодействуют с З'-концевьш нуклеозидом через определенный спейсер, например фрагмент янтарной кислоты. На рис. 82 представлена схема фосфорамидитного синтеза олигонуклеотида.

Хотя оба метода позволяют получать полинуклеотиды длиной до 100 нуклеотидов и более, с их помощью нельзя получить функциональные гены. Поэтому синтетические олиго- и полинуклеотиды, используемые для сборки гена, и в настоящее время сшивают способом, который на заре развития полинуклеотидно-го синтеза был предложен Г.Корана для соединения 20-мерных олигонуклеоти-дов, полученных фосфодиэфирным методом (рис. 83). Для соединения олигонук-леотидов I и II используется третий, вспомогательный, нуклеотид III, который комплементарен 5 '-концу одного и 3 '-концу другого олигонуклеотида, образуя дуплекс с ником. Этот вспомогательный нуклеотид III играет роль матрицы для олигонуклеотидов I и II, причем его 3'-конец комплементарен 3'-концу олигонуклеотида II, а 5'-конец — 5'-концу олигонуклеотида I, несущего фосфо-моноэфирную группу. Размер матрицы должен обеспечивать достаточную устойчивость дуплекса с ником, для чего каждый из сшиваемых олигонуклеотидов должен перекрывать матрицу III длиной по 8—10 пар нуклеотидов. Обработка комплекса олигонуклеотидов I, II и III ДНК-лигазой в присутствии доноров остатков AMP (ATP или NAD*) приводит к сшиванию олигонуклеотидов I и II. Как видно из рис. 83, двуцепочечный фрагмент образуется с выступающими одно-цепочечными концами. Эти концы могут быть использованы для дальнейшего наращивания цепи. Для этого необходимо синтезировать олигонуклеотиды IV и V, частично перекрывающие выступающие 3'- и 5 '-концевые фрагменты I — И нуклеотида. Обработка комплекса, содержащего олигонуклеотиды I — II, III, IV 298

и V, ДНК-лигазой приводит к устранению двух пиков и образованию двуце-почечной структуры, состоящей из олигонуклеотидов I — II и IV — III — V с выступающими одноцепочечпыми фрагментами. Очевидно, что процесс можно повторять до тех пор, пока не будет получена ДНК' требуемого размера. Дальнейшие манипуляции с синтетическими генами подробно описаны в § 7.11.

Олигорибонуклеотнды можно получать синтетически, используя оба метода, как фосфитамидный, так и Н-фосфонатный, и снптоны, содержащие обратимо защищенную 2'-ОН-группу. В качестве примера можно привести синтон (114), у которого 2 '-ОН-группа защищена тетрагидропиранильным остатком:

114

Эта защитная группа достаточно стабильна, выдерживает все промежуточные обработки во время роста олигонуклеотида и легко удачяется по завершении синтеза.

Для синтеза достаточно длинных полпрпбоиуклеотидов широко используют транскрипцию предварительно синтезированных ДНК-дуплексов нужной структуры. Эти дуплексы снабжаются промоторами для используемой при транскрипции РНК-полимеразы, а следующая за промотором транскрибируемая последовательность комплементарна требуемой последовательности м создаваемой РНК. Наиболее широко используются РНК-полимеразы фагов Т7 и SP6 (хозяином этого фага является Typhi murium salmonel la). Эти полпмеразы позволяют получить до нескольких тысяч РНК-копий на каждую ДНК-матрицу.

7.11. ГЕНРГГИЧЕСКЛЯ ИНЖЕНЕРИЯ

По мере того как становятся доступными в количествах, достаточных для серьезных биологических исследований, различные индивидуальные белки, расширяется видимый спектр их важных практических приложений. В предыдущих параграфах уже упоминались инсулин, необходимый многочисленным пациентам-, страдающим диабетом, и нуклеазы, оказавшиеся эффективными противовирусными препаратами. Этот перечень может быть продолжен. Он включает гормон роста, который открывает перспективы существенного повышения продуктивности животноводства; группу родственных белков, известных под названием интер-феронов, которые вырабатываются в организме человека и животных при вирусной инфекции п введение которых в организм при заболевании и при эпидемиях Дает существенные лечебные и профилактические результаты; ряд белков, стимулирующих определенные этапы иммунного отпета, например иптерлейкины, и т.д. Вес ьма многообещающим для профилактики вирусных заболеваний выглядит создание так называемых субъедипнчных вакцин, состоящих из вирусных белков и не содержащих нуклеиновой кислоты. Вирусные белки являются главными,

299

если не единственными, вирусными антигенами, т.е. именно па них вырабатывается иммунный ответ. Два наиболее широко используемых типа противовирусных вакцин представляют собой либо так называемые живые вакцины, либо инакти-вированный вирус. В первом случае речь идет о способных размножаться в организме пациента вирусах, структура которых изменена таким образом, что они стимулируют образование антител против вируса, но не вызывают заболевания или вызывают его в облегченной форме. Классическим примером является вирус осповакцины, на протяжении более ста лет использовавшийся для создания у людей иммунитета против черной оспы. Получены живые вакцины и против некоторых других опасных заболеваний, например полиомиелита. Однако в случае живых вакцин сохраняется опасность их перерождения в сильные патогены. Наиболее распространенными являются вакцины, полученные инактивацией вирусов путем их облучения или химической обработки, например формальдегидом. Обработка проводится с таким расчетом, чтобы вирус потерял инфекционные свойства, но еще сохранил способность вызывать иммунный ответ. Поскольку возможность сохранения неизменных вирусных частиц должна быть полностью исключена, обработка делается с определенной избыточностью, что резко снижает способность модифицированного вируса стимулировать образование полноценных антител. Использование вирусных белков, свободных от вирусной нуклеиновой кислоты, полностью снимает как опасность перерождения, так и необходимость какой-либо обработки белков, а тем самым и потери снижения их иммуногенностп.

Однако существующие способы производства белков, а иногда и их источники в ряде случаев малодоступны. Так, белки, используемые в медицине н предназначенные для введения в организм человека, должны, как правило, быть человеческого происхождения. В противном случае они могут содержать чужеродные антигенные детерминанты п вызывать иммунный ответ. Их многократное применение может вызвать сильную аллергическую реакцию, вплоть до шока и гибели человека. Даже такой небольшой и поэтому обладающий чрезвычайно слабыми антигенными свойствами белок, как бычий инсулин, в отдельных случаях оказывается неприемлемым для многократного применения, и среди больных диабетом существует прослойка, небольшая в процентном отношении, но весьма значительная в абсолютном выражении, которая нуждается в человеческом инсулине. Между тем естественным источником человеческого инсулина может служить лишь трупный материал. Человеческий интерферон получают из лейкоцитов, т.е. его природным источником может служить только донорская кровь, что делает производство интерферона весьма дорогостоящим. Некоторые практически значимые белки, например гормон роста, содержатся в соответствующих тканях в таком ничтожном количестве, что выделение их в производственном масштабе крайне нетехнологично. Вирусные белки можно получать из вирусов, отделяя тем пли иным путем нуклеиновые кислоты, но это требует наработки значительных количеств вируса, что сопряжено с высокой вероятностью заражения работников такого производства.

В связи с этим в середине 70-х годов в биотехнологии начало интенсивно развиваться новое направление, предусматривающее создание биологических объектов для производства белков животных и человека вне этих организмов и основанное на введении генов, программирующих соответствующие белки, в генетические структуры одноклеточных, в первую очередь бактерий. Это потребовало 300

конструирования специальных молекул ДНК, несущих целевой ген и одновременно способных размножаться вместе с бактериальными клетками, чаще всего в клетках E.coli, и при этом экспрессировать заложенную в них генетическую информацию. Такое направление биотехнологии получило название генетической инженерии, а создаваемые ДНК получили название рекомбинантних ДНК. Менее чем за 20 лет генетическая инженерия превратилась в огромную область человеческого знания и его практической деятельности. В рамках общего курса биохимии можно дать лишь некоторые основные представления об этой области.

Чтобы создавать рекомбинаптные ДНК, несущие желаемый ген, необходимо прежде всего располагать этим геном. Для этого используют три основных способа. Во-первых, если известна первичная структура белка, получение которого желательно осуществить методами генетической инженерии, можно, основываясь на генетическом коде, построить нуклеотидную последовательность, программирующую этот белок, и осуществить химико-ферментативный синтез гена. Так, например, были осуществлены синтезы нескольких генов, кодирующих различные интерфероны. Во-вторых, можно выделить из тканей, в которых происходит экспрессия гена, информационные РНК, среди которых должна присутствовать и мРНК, кодирующая необходимый белок, провести с помощью обратной транс-к

страница 73
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.11.2017)