нейтрализация! (H,C),-CH-N-CH—(СН,),. DMF I С,Н,СН, о
? * и
?,?-CH-C-O-
-(^-CH2-C-NH-CH,-(^
? СН, О О
конденсация I H,C-c-o-C-NH-CH-C-OH ¦
V N
™» дцк ««? ^^^V
сн, о о сн, о
u. I 1 и I и
HjC-c-O-C-NH—СН—С—NH-CH-C—О-
сн, сн,
~^>-сн2 -с-нн-снг^К?)
о*с~ - \w/
— ? Н,С—С Использование уксусного кэпирование Л ангидрида для блокирования
ш и с_С
' з чч непрореагировавших а-аминофупп первый цикл 0
^Следующие циклы активации с ВОС защищенными аминокислотами
Снятие синтезированного пептида . HS_R /н0_/^\ с носителя, очистка и выделение ', у-—/
продукт. * H,CCOOH/H,0
Pro-Oln-Ile-Thr-Leu-Trp-Oln-Axg-Pro-Leu-Val-Thr-Ile-Lye-Ile1' Gly-Gly-Qln-Leu-Lye-Glu-Ala-Leu-Leu-Aep-Thr-Qly-AlB-???-???'30 Thr-Vel-Leu-Glu-Glu-ltet-Ser-Leu-Pro-Gly-Axg-Trp-Lye-Pro-Lye4* aly-aly-Ile-Oly-Oly-Phe-Ile-Lye-Vel-Xrg-aln-Tyr-Aep60 aln-Il«-L«u-Ile-alu-Il«-CyB-01y-HiB-Lya-Ala-Il«-ely-Thr-VBl75 Leu-Val-Gly-Pro-Thr-Pro-Val-Aen-Ile-Ile-Gly-Arg-Aen-Leu-Leu90 Thr-Gln-Ile-aiy-Cye-Thr-L«u-A«n-Ph»99
Рис. 81. Схема твердофазного метода синтеза по Меррифилду 99-членного пептида, предста юшего собой протеазу, кодированную вирусом ВИЧ-1, вызывающим СПИД
сот химических процедур, не считая промывЪк предшествующих каждой смене реагента. На завершающей стадии защищенной пептид, ковалентно связанный со смолой, снимается с нее и защитные группы уДаляютСя соответствующими обработками (рис. 81).
Одной из тяжелых проблем, возникающих при полипептидном синтезе, является рацемизация аминокислот во время син^за Активация аминокислот вызывает частичное превращение их в так называете азлактоНы (ПОа), например по реакции с ДЦК из интермедиата (102):
¦V Z-C=N-CHR + ДЦМ I I
о—с=о
110а
Азлактон является активированной формой <:0ответствующей ациламинокислоты и может также участвовать в полипептидном синхезе. Однако он может частично таутомеризоваться в (1106):
Z—C=N—CHR Z--C=N_CR
II I II
0-С=0 0-c-flH
1106
Обратное превращение таутомера (1106) в азлакхон происходит нестереоселектив-но и приводит к рацемизации аминокислотное остатка. Это особенно опасно при твердофазном синтезе, так как в этом случ^е не используются промежуточные стадии очистки и происходит постоянное накопление диастереомеров в растущей полипептидной цепи. Не существует способов позволяющих целиком избежать рацемизации. Однако ряд активирующих п00цедур позволяет снизить степень рацемизации. Наилучшие результаты достига^^ использованием ДЦК в смеси с нуклеофильным катализатором, например ги.Цр0ксибензотриазолом в этом слу_ чае ?-ацетиламинокислота (чаще всего Вос-а^инокислота) превращается in situ в активированный эфир, который существенн0 меныпе склонен к образованию азлактон а.
7.10. ХИМИЧЕСКИЙ СИНХЕЗ ОЛИГО- И ПОЛИНУКЛЕОТИдов
Термодинамические и кинетические проблемы, возникающие при химическом синтезе нуклеиновых кислот, не отличаются от уже рассмотренных при пептидном синтезе. Соединение остатка фосфорной КИСЛОТы с 0Н-группой соседнего нуклеотида неблагоприятно ни термодинами^ески (процесс сопровождается увеличением свободной энергии системы), ни ьинетически, поскольку необходимо взаимодействие двух нуклеофильных остатьов jja первом этапе становления химического синтеза олиго-, а затем и полин^ео^дов развитие пошло по тому же пути, который был использован и в пептиДном синтезе, а именно по пути
N-C6Hn II
Z-C-NHCHRC-0-C
II II I
0 0 ??-СбНц
превращения фосфатных остатков в электрофильные производные с одновреме ным обеспечением их избыточной свободной энергией за счет сопряженного экзэргонического процесса. Так же как и при пептидном синтезе, для получения упорядоченных олигомеров необходимо использовать защитные группы, чтобы на каждом акте конденсации соединять между собой строго определенные фосфо-рильную и ОН-группу, не давая развиться неупорядоченному процессу статистической поликонденсации. Наличие у трех нуклеотидов экзоцнклических аминогрупп потребовало введения защит по этим группам, достаточно устойчивых, чтобы сохранять их на протяжении всего синтеза, и в то же время удаляемых по завершении синтеза без повреждения образовавшихся межнуклеотидных связей.
Первый синтез функционального гена был осуществлен Гобиндом Корана с сотр. Синтез состоял из трех основных стадий: получения защищенных мономеров, конденсации их в олнгонуклеотнды достаточной длины и объединения их в двуцепочечную ДНК с использованием ДНК-лигазы, описанной в § 5.4. Поскольку метод включает ферментативную стадию, его называют химико-ферментативным синтезом. Первый подход к образованию межнуклеотидных связей основывался непосредственно на образовании фосфодиэфирной связи и получил название фосфодиэфирною метода синтеза. Фосфатный остаток одного компонента (Р-компонент) активировали путем превращения в электрофильное фосфорилиру-ющее производное и использовали его для этерпфикацпп ОП-группы второго компонента (ОН-компонент). Наилучшие результаты были достигнуты при применении триизопропилбензосульфонил хлорида, который, как было показано, в растворе пиридина дает высокореакционноспособное фосфорилпиридиниевое производное Р-компонента (111):
0 О
II II R0-P-0- + (г - Pr)3Cr,HoS0>Cl [UQ-P-OSU,С61Ь( t - Pr)3] -»
1 " ' I
о- о-
то
+пириди
^ RQ-P-N<^©^> + (* - Pr)3CelbSQ; + CI- (VII.23)
О" 111
Это производное легко реагирует с гидроксигруппой ???-компонента: О О
R0-P-N<^©^> + 1I0R' -» RQ-P-0R' + 11N'<^©^> (VI1.24)
О" 0"
где R, R — нуклеозидные или нуклеотндные фрагменты. Для того чтобы защитить аминогруппу аденина, цитозина и гуанина, соответствующие нуклеозиды или нуклеотиды предварительно превращали в ?-бензоил, ?-анпзоил или ?-бу-тирильное производное. Эти защитные группировки до сих пор остаются наиболее популярными в современных методах конденсации. Тем не менее прямое образование фосфодиэфириых связей оказалось малоэффективным из-за ряда 294
побочных реакций, приводящих к ощутимому снижению скорости реакции и выходам, далеким от количественных.
Фосфоэфирная конденсация была существенно улучшена путем введения синтонов, которые в совокупности с достаточно стабильными защитными группировками фосфатной группы (главным образом 4-хлорфенил) приводили к образованию межнуклеотидных фосфатных фрагментов, защищенных арильным остатком. Этот метод до сих пор используется и называется фосфотриэфирным методом олиюнуклеотидною синтеза. Хорошие скорости конденсации были достигнуты при использовании в качестве конденсирующего реагента (/-Рг)з CeHaSOjCl в присутствии нуклеофильного катализатора, например ?-метил-имидазолида. Основные стадии фосфотриэфирной конденсации могут быть представлены в следующем виде:
0
N
R0—P—0" + ArS02Cl + | ОАг
.СН3
R0-P-
СНя
+ ArS03H + НС1
ОАг 112
О СНз (112) + H0R' -+ R0—?—OR' + ж I (VII.25)
<=1
ОАг
Однако в настоящее время синтез олигонуклеотидов в основном перешел на методы, основанные на фосфитной химии. Наиболее популярным из них является использование в качестве синтонов фосфитамидов (фосфорамидитов) (фосфит-амидный метод синтеза). Синтоны, используемые в этом методе, имеют строение
DinTr-0—? / 0 ^ Htr
0—P(0X)N(i-C3H7)2
где DMTr — 5 '-бис-(я-диметоксифенил)фенилметил (диметокситритил), Htr — М(6)-бензоиладенин, М(4)-бензоилцитозин или г!(2)-г-бутирилгуанин;
X = СН3 или СИ2СН2С^
Образование связи между Р- и ОН-компонентами в фосфитамидном методе происходит за несколько минут по сравнению с несколькими часами при фосфотриэфирной или несколькими днями при фосфодиэфирной конденсации. Фосфит-триэфирный фрагмент далее окисляется раствором 12. Таким образом, основные стадии конденсации можно представить в следующем виде:
ЛАЕ
dmtNuc'p — CO(CH2)3COOH + NH2(CH2)3Si-
ArSOjCi, ? - метилимидазол dmtNuc'p —CO(CH2)3CO —NH(CH2)3Si
(Спейсер g^^^tg ] CF3COOH В CHjCLj
honuc;.,-----Nuc;— IZZZZ2-
1dmtNuc;-OP(OCH3)N(/so-C3H,)3 ?" (тетразол) в ацетонитриле
dmtNuc'(0 —?—ONucj.,-----Nuc,—ЩЩШ
OCH,
CF3COOH В CH2CI2
(CHjCO)ao (кэпирование) 4-диметаламилогшридин, ацетонитрил
dmtNuc',0 —? —ONuc].,-----Nuc',—
OCH,
О
•а/ в водном пиридине
dmlNuc,0—?—ONucJ^------Nuc', —m
OCH,
i.=n
J NH
в диоксане
3 (КОНЦ)
dmlNuc„0 —?—ONucn.,0-----Nuc,
Г.----Ъ~~'--------?
К II г s "^?
I NiicnО —? —ONuc-,0-¦·¦ — Nuc'^'i
I
.0-
R0-P(0X)-N(i-C3H7)2 + HOR' —* RO-P(OX)-OR' + NH(i-C3H7)2
0
II
RO-P(OX)-Ru ' + I2 + H20 -» RO-P-flR' + 2HI (VII.26)
I
OX
Метальные и цианэтильные, а также ацильные остатки, защищающие экзоцик-личные NH2-rpynnbi гетероциклов, удаляются по завершении сборки полной полинуклеотидной цепи.
Другой метод, основанный на фосфитной химии, обычно называют ff-фос-фонатным методом синтеза. В этом методе используются Н-фосфонатные синтоны
DinTr—? / Оч Htr
о—?—?-?
и
113
Н-фосфонаты активируют обработкой пивалоилхлоридом (СНз)зСС(0)О. Межнук-леозидные Н-фосфонатные связи достаточно стабильны и могут окисляться до фосфата по завершении образования полинуклеотидной цепи. Конденсация приводит к Н-фосфонат фосфодиэфиру согласно реакции
0 О
II II RO-P-0" + (CH3)3CC(0)C1t-R'0H-^R0-P-0R' + СГ Ш127)
1 I
? II Перед каждой стадией конденсации как в фосфитамидном, так и в Н-фосфонат-ном методе остаток DMTr удаляется с растущей полинуклеотидной цепи слабой кислотной обработкой, освобождая 5 '-ОН-группу для следующей стадии роста синтезируемой цепи.
Оба метода легко автоматизируются в твердофазном варианте аналогично методу, предложенному для пептидного синтеза Меррифилдом. Более того, фос-фитная химия вообще чрезвычайно редко применяется в жидкофазном варианте. В качес