Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

(Ш. 19)

Эти соединения содержат электрофильную ангидридную группу, которая может атаковать алифатическую аминогруппу аминокислоты, используемой в качестве затравки, с выделением С02 и одновременным освобождением новой аминогруппы из атакующей молекулы ?-карбоксиангидрида. Это создает условие для проведения реакции со следующей молекулой ?-карбоксиангидрида, таким образом открывая возможность продолжения поликонденсации:

NH—Cffit,—С=0 + NH^-CHR^OO-—тК

NH^-CHR --c(0)^-chr—coo- + с02

102

0

102

NH3-CHR-C(0)-^H-CHRi-C(0)^ffl-CHRi-c00- + С02

(VII.20)

Нетрудно заметить, что с учетом реакции (VII.19) каждая стадия поликонденсации сопровождается превращением молекулы С0С12 в С02 и 2НС1, что термодинамически выгодно и является источником свободной энергии для образования пептидной связи.

При синтезе нерегулярных полипептидов используются другие методы активации карбоксильных групп. Большинство из них базируется на использовании ?,?-дициклогексилкарбодиимида (ДЦК). Этот реагент, будучи добавленным в смесь карбоновой кислоты RC00" и амина NH2R', способен осуществлять активацию карбоксильных групп in situ по реакции

rc00- + С6НП—N=C=N—С6Н„ ^-> CfiHl1 NH C=N СбН

0—C(0)-t 103

-> C6Hn—NH—С—NH—С6Н„ + R—С—NH—R'

+ nh2r;

(VII.21).

о

о

Процесс протекает через высокореакционноспособное промежуточное соединение (103), представляющее собой О-ацил-?,? '-дициклогексилизомочевину. Термодинамически движущей силой процесса является экзэргоническая гидратация ДЦК до дициклогексилмочевины (ДЦМ):

С6Н„-N=?=^-С6Н„ + Н20

-» СбН„—NH-С—NH

0

бНц

Обычно тем не менее в пептидном синтезе ДЦК используется не непосредственно, а для получения достаточно стабильных реакционноспособных производных аминокислот, ангидридов или активированных эфиров путем реакции с соответствующими гидрокси соединениями:

2RC00- + ДЦК [RC(0)]20 + ДЦМ

RC00" -I- H0X

+Н+

RC(0)0X -I- ДЦМ

Будучи достаточно активными нуклеофилами, активированные эфиры (103) - (107) должны содержать сильный электронный акцептор X. В ряду разнообразных активированных эфиров необходимо отметить такие, как производные п-нитрофенола (104), пентафторфенола (105), ?-гидроксисукцинимида (106), ?-гидроксибензотриазола (107):

(0)—0-С6Н4-N02

104

R-С(0)—0-

106

R—С(0)—0-

0?

R—С(0)—0—C6F5 105

107

В пептидном синтезе также широко используются азиды аминокислот (108). Их легко получают последовательной обработкой эфиров аминокислот гидразином и азотистой кислотой:

RC(0)-0с2Н;

NH2NH2

RC(0)—NHNH2-

HN0,

RC(0) 108

+ 2H20

¦??

Тем не менее ни одно из этих производных нельзя непосредственно использовать для синтеза пептидов определенной структуры. В самом деле, смешивая две аминокислоты с активированными карбоксильными группами, можно получить уже на первой стадии процесса образования четыре разных дипептида:

/ШгСНй^СО)-NHCHR2C(0)-ОХ

NH2CHRiC(0):—ОХ + NH2CHR2C(0)—ОХ

4h2CHR2C(0)—NHCHRjCCO)—ОХ

2NH2CHR1C(0)—ОХ-/nHjCHR^O)—NHCMiC(O)—ОХ

2NH2CHR2C(0)-ОХ-> NH2CHR2C(0)-NHCHR2C(0)-OX

Более того, каждый из этих дипептидов остается реакционноспособным, сохраняя одну из нуклеофильных аминогрупп и одну активированную карбоксильную

группу С(0)-ОХ. Поэтому процесс не останавливается на стадии образования

дипептида, а продолжается дальше. Следовательно, в такой смеси можно получить только статистический сополимер.

Для того чтобы обеспечить возможность образования только одного дипептида, необходимо предотвратить образование трех остальных. Очевидно, для того чтобы получить дипептид NH2CHRiC(0)—NHCHR2C00", необходимо исключить участие в процессе аминогруппы первой аминокислоты и активированной карбоксильной группы второй. В пептидной химии это достигается использованием защитных групп ? на тех функциональных группах, которые не должны вступать в реакцию. Реакция

Zi—NHCHR^O—OX + NH2CHR2C0-Z2-> 7>?-NHCffll|CO-NHCHR2C0-Z2

должна приводить к одному определенному дипептиду. Этот дипептид нереак-ционноспособен и для продолжения процесса необходимо удалить одну из групп Zi, Z2, для того чтобы открыть либо ??2-, либо СООН-группу для следующей стадии удлинения пептидной цепи. Главным требованием к защитным группам Zi и Z2 является возможность их селективного удаления при достаточно мягких или специфических условиях, при которых не затрагиваются другие защитные группы и образованная пептидная связь. Наиболее широко для защиты о-аминогрупц используется mpem-бутилоксикарбонильная группа (Вое), которую легко ввести в аминогруппу обработкой аминокислоты соответствующим ?-гидроксисукцинимид-ным эфиром:

СН3 I

СН3—С—0С(0)—о

? >-·

СНз

109

Эту группу можно удалить слабой кислотной обработкой пептида, при которой пептидная связь не разрушается:

(CH,),C-O-q0)-NHCHC0OH ¦ HjNCHCOOCH,

CHjC,He CHjCHjScri,

jr ДЦК + гидроксибензотриазол (1) j обработка кислотой(2) j нейтрализация (3)

(CHjljC-O-qO-NHCHjCOOH + NHaCH~C(0)-NHCHCOOCH,

j (1) СН2С,Нб CHjCHjSCH,

I (2) l (3)

(CHjJjC-O-CiO-NHCHjCOOH + NHjCHj-CiOJ-NHCH-CiOJ-NHCHCOOCH,

J (1) CHjCgH, CH2CH2SCH,

j (2)

l (3)

(CH,),C-0-C(0)-NHCHCOOH

CHjCeH4OH

+

NHjCHj-CiO)—NHCH2-C(0)NHCH-qO)-NHCHCOOCH,

CHjC.Hj CHjCHjSCHj

I (1)

I (2) \ (3)

NHjCH-C^-NHCHj -qO-NHCHj -qO)-NHCH-C(0)-NHCHCOOCH, CHjC,H4OH CHjC.H, CHjCHjSCH,

I обработка щелочью

Tyr-Gly-Gly-Phe-Met

Рис. 80. Схема синтеза пентапептида метионин-онкефалина

(СНз)зС-О-С(О)-NHCHRjCiO)-NHCHR2C(0)-Z2

+11*

-> (СН3)2С=СН2 + С02 + NH2CHR,C(0)-NHCHR2C(0)-Z2 (VII.22)

В качестве группы Z2 используют эфирные группы, которые стабильны в кислой среде в условиях проведения синтеза и могут быть селективно удалены мягкой щелочной обработкой. На рис. 80 приведена в качестве примера схема синтеза пентапептида метионин-знкефалина.

Реакции, используемые для образования пептидной связи и удаления защитных групп, могут повреждать ряд боковых функциональных групп. Поэтому использование защитных групп важно не только для ?-амино- и о-карбоксиль-ных групп, но и для многих боковых радикалов. Эти группы должны оставаться защищенными во время всего процесса образования полипептндной цепи и должны удаляться только по завершении процесса. В практике полипептидного синтеза используются различные комбинации этих групп. Они вводятся в мономеры в дополнение к группам, защищающим o-NH2- и а-С00--группы. Мономеры, содержащие набор защитных групп и в ряде случаев активированные остатки, делающие возможным их непосредственное использование в процессе синтеза, обычно называют синтонами. В качестве примера, в табл. 7.6 приведены синтоны, использованные для синтеза 99-членного пептида, который представляет собой протеазу, кодированную вирусом ВИЧ-1, вызывающим СПИД. Эта протеаза важна для протеолитического разрезания больших полипептидов, образовавшихся при трансляции вирусных мРНК. Огромный интерес к этой протеазе обусловлен надеждой найти специфические ингибиторы протеазы, которые позволят предотвратить созревание вирусных белков и, следовательно, размножение этого вируса.

Таблица 7.6. Синтоны, исполъэовашсые для синтеза протеазы ВИЧ-1

Аминокислота

Защитная группа

Реагент для защиты боковых радикалов аминокислот

Реагент

для снятия защиты

Аргинин

Тозил

О

II.

СН,

HN—С—О—С—СН

¦S-CI

HF

288

Продолжение табл. 7.6

Аминокислота

Аспара-гиновая и глутами-новая кислоты

Защитная группа

Цикло-гексил-окси

Лизин

Тиро:

'ЗИН

4-Хлоро-

карбо-

бензокси

2-Бромо-

карбо-

бензокси

Гист:

идин

Вензил-оксиме-тил

Синтон

HN—С—О—С—СН, СН,

/>

СН-(СН2)п-Сч /—\

соон (П=1>2) °-\_/

HN—С—О—С—СН,

СН

CH-(CH2)-NH-C

соон о с1-<^>-сн,

о

II

сн,

HN—С-О-С-СН,

сн.

<-с"г<0ъ<

CH-CHr<( )У-0-С'

соон ~_? 9

Br

о сн.

II ? 1

??—С—О—С—СН.

1 *

сн,

CH-CHj

СООН N^N-CHj-0-CH,

Реагент для защиты боковых радикалов аминокислот

Реагент

для снятия защиты

НО

в присутствии

Н,С

¦дцк

HF

Вг

(^^-CHj-O-CHjCI

HF

HF

HF

? Биологическая :

Продолжение табл. 7

Серии

Бензил

Треонин

Бензил

Реагент для защиты j Реагент боковых радикалов для аминокислот снятия

HN—С—О—С—СН,

СН,

СИ-СН;

I

соон

1,°

н

??—С—О—С—СН, СН,

сн-снг-о-сн2 I 2 1 2

СООН

о

и

СН,

??—С—О—С—СН,

i *

?

I

сн-с-сн.

СН,

HCI /не

ОН

NaH

защиты

HF

HF

(^V-CHjBr,

NaH

290

Продолжение табл. 7.6

Аминокислота t Защитная группа Синтон Реагент для защиты боковых радикалов аминокислот г ! Реагент ДЛЯ снятия защиты

Цистеин 4-Метил-бензил О СН, II ? 3 HN—С—О—С—СН, ? 3 сн, сн-сн—S-CH2 СООН JQJ СН, HjC-^^^-CHjBr HF

Ацетами-дометил О СН, II 1 3 HN—С—О—С—СН, СН-СН,—S-CH,-NHCv 1 сн, СООН h

Специфической особенностью полипептпдного синтеза является огромное число идентичных стадий, которые необходимо проводить на каждом этапе удлинения цепи: образование новой пептидной связи, удаление защитной группы для подготовки к следующей стадии элонгации цепи и промежуточные отмывки от избытка реагентов и побочных продуктов после каждого химического превращения. Метод, предложенный Робертом Меррифилдом, дал возможность автоматизировать этот процесс и снизить механические потери. Согласно этому методу, первый мономер во вновь строящейся цепи синтезируемого полипептида кова-лентно связывается с нерастворимым носителем (смолой) и все последующие стадии проводятся с полипептидом, растущим на этой смоле. Этот метод известен как твердофазный синтез полипептидов. К смоле попеременно добавляют очередной синтон и реагент для удаления концевой защитной группы, остаток). Химические стадии перемежаются соответствующими промывками. В течение всего процесса полипептид остается связанным со смолой. Поместив в колонку смолу, с которой связан синтезируемый полипептид, можно легко автоматизировать процесс, запрограммировав смену потоков через колонку: синтон (мономер) — растворитель — смесь для удаления защиты — растворитель и т.д. Разработаны специальные приборы для автоматизи

страница 71
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(29.04.2017)