Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

новления структуры РНК с той существенной разницей, что описанные для ДНК химические 280

Рис. 78. Радиоавтограф геля, полученного методом Максама-Гилберта а

и прочитываемая по этому гелю последовательность секвенированного G О

участка кД ? «-фрагмента генома, вируса, клещевого энцефалита, (по дан- ¦ ¦

ным А.Г. Плетнева.) ™ Щ

Электрофорез проводился в 4%-ном полиакриламидном геле в присутствии _ ш 8 моль/л раствора мочевины. Над дорожками, в которых проводилось разделе- :— За ние 32Р-меченного фрагмента после селективного расщепления по гетероциклам, L-,< s указано, по каким нуклеотидам проводилось расщепление Г"" 5

?

¦ С

методы для расщепления по звеньям определенного типа в случае РНК неприменимы. Однако для РНК известны ферменты, расщепляющие полирибонуклеотидную цепь по определенным типам нуклеотидов, так что общая методология может быть использована и в этом случае.

Практически параллельно с методом Максама — Гилберта был развит другой метод секвенирования ДНК, получивший по имени создавшего его автора название метод Сэнгера. Этот метод считается наиболее перспективным для исследования первичной ртруктуры больших молекул нуклеиновых кислот, вплоть до ДНК хромосом человека. В его основе лежит анализ структуры не самой нуклеиновой кислоты, а продукта, получаемого в ходе ее репликации с помощью ДНК-полимеразы. Аналогично, используя обратную транскрипцию, с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы можно анализировать структуру молекул РНК.

В своем оригинальном варианте метод заключается в использовании исследуемой ДНК в качестве матрицы для ДНК-полимеразы I из E.coli, или, точнее, так называемого фрагмента Кленова, который получают из ДНК-полимеразы I после протеолитического отщепления домена, ответственного за 5' — 3 -экзонуклеазную активность. При этом в реакционную смесь вместе с четырьмя дезоксирибонуклеозид-5 '-трифосфатами (дНТФ) добавляют один из 2' ,3'-дидеэоксирибонуклеоэид-5'-трифосфатов (ддНТФ):

В = Thy -ддТТФ

в = Cyt -ЯДЦТФ

в = Ade -ддАТФ

в = Gua -ддГТФ

ООО

-о -о -о \_I

101

Необходимо также добавление праймера (см. § 5.1), комплементарного некоторому участку исследуемой матрицы. Структура участка должна быть заранее установлена, этого можно достигнуть, например, анализом последовательности нуклеотидов небольшого фрагмента исследуемой ДНК методом Максама — Гилберта.

В такой системе начинается удлинение праймера, т.е. синтез

а

•G А А С А А С А А А G С А С С А А А С G А С

А А

G А

6 ? А

G 'С С А G G С С G

? С А С С А ?

с

А

? с ? с ?

А

с

G А

С С G ? С

А А

G А А

G G С С ?

с ?

G G А G С

9Я1

Ж|X^XjX^XjX^X ? ? ? XX ? ???? А А ? ?

6) ?,?,?,?,?,?????^?] •i XjXjXjX^i^jX^X ? ? ? xx5d_Tj

? ? ?XjXjX^XjX^X ? ? ? XX ? ххххрйт]

д) ? |XjX|X^XjX^X ? ? ? ?? ? ???? ? gPf

·) XjXjXjXjXjXfX ? ? ? XX ? ???? ? ? Xgjdtl

Рис. 79. Схема установления последовательности ДНК по Сзнгеру (а):

Х^Х.чХ^Х.^Хо-праймер; ?·? - комплементарная пара нуклеотидов (ХуА); б - н - набор синтезированных олигонуклеотидоь с ddT " (дидезокситимидинмонофосфатом) на 3 '-конце

ДНК, комплементарной анализируемой матрице. Дидезоксинуклеозид-5'-трифос-фаты являются близкими структурными аналогами природных субстратов ДНК-полимеразы и, несмотря на отсутствие 3 '-гидроксигруппы, опознаются ферментом и матрицей и включаются в строящуюся полинуклеотидную цепь. Если такое включение произошло, то дальнейший рост цепи прекращается, так как присоединившийся дидезоксинуклеотидный фрагмент лишен 3 '-гидроксигруппы, необходимой для присоединения следующего звена цепи. Таким образом, ддНТФ играют роль терминаторов репликации. Так как наряду с введенным в реакционную смесь ддНТФ в ней присутствует аналогичный природный субстрат, то тер-минация на каждом данном участке происходит в небольшом числе случаев и статистически, т.е. возникает набор олигомеров или полимеров разной длины. При этом если, например, в реакционную смесь был введен ддТТФ, то получаемый набор продуктов представлен фрагментами, имеющими на 3 '-конце остаток ддТТФ, длины которых соответствуют порядковым номерам остатков дТМФ в синтезируемых продуктах, если вести отсчет от 5 -конца праймера (рис. 79). Эти порядковые номера находят, как и в методе Максама — Гилберта, после разделения полученной смеси фрагментов электрофорезом в полиакриламидном геле по положению соответствующих им полос на снятой с геля фотокопии. Полученные номера одновременно являются номерами остатков дАМФ исследуемой матрицы, отсчитываемыми от ее звена, взаимодействующего с 5 '-концом праймера.

Аналогично, приготовляя такие же реакционные смеси, в которые вместо ддТТФ введены ддЦТФ, ддАТФ или ддГТФ, можно определить положение на матрице остатков дГМФ, дТМФ и дЦМФ, а следовательно, и полную последовательность нуклеотидов реплицированного участка матрицы. Таким способом может быть прочитана последовательность в несколько сотен нуклеотидов. После этого можно синтезировать олигонуклеотид, комплементарный 5 '-концу секвени-рованной последовательности, и использовать его в качестве праймера для проведения следующего цикла секвенирования.

В исходном варианте для изложенного метода определения последовательности нуклеотидов использовали дезоксинуклеозид-5 '-трифосфат, меченный радиоактивными изотопами 32Р или 33Р в ?-положении трифосфатной группы. Радиоактивная метка попадала в каждое звено синтезируемой цепи, что обеспечивало высокую чувствительность метода.

В настоящее время наметилась тенденция к переходу на менее чувствительный, но зато легко поддающийся автоматизации флуоресцентный метод. С этой целью либо к праймеру, либо к терминирующим ддНТФ присоединяют специальные красители, дающие при облучении лучом лазера интенсивную флуоресценцию. В специальных приборах для автоматического секвенирования по ходу электрофореза в некоторой области геля проводится непрерывная регистрация интенсивности флуоресценции и ее спектральных характеристик. Таким образом, ход разделения фиксируется сразу во время электрофореза. При этом для анализа распределения вдоль синтезируемой цепи ДНК каждого из четырех нуклеотидов используют четыре разных красителя, отличающихся спектрами флуоресценции. Анализируя спектры каждой полосы, проходящей через регистрирующее устройство, можно сразу определить, какому красителю, а следовательно, какому нуклеотиду эта полоса соответствует, т.е. проводить определение последовательности на одной дорожке вместо четырех. В сочетании с достаточно мощными ЭВМ, обеспечивающими быструю обработку спектральных данных, поступающих с большого числа дорожек геля, можно одновременно анализировать много образцов. Этот подход положен в основу создания техники, позволяющей на одном приборе определять последовательности нескольких сотен тысяч нуклеотидов в течение суток. Такие темпы стали весьма актуальны в связи с уже ведущимися работами по установлению полной первичной структуры ДНК всех хромосом человека (структуры генома человека), которые содержат несколько миллиардов пар нуклеотидов.

7.9. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ

Химический синтез полипептидов и белков имеет большое теоретическое и практическое применение. Пептидные модели широко используются для изучения белок-белковых и белково-нуклеиновых взаимодействий. Некоторые гормоны являются пептидами и необходимы в больших количествах для медицинских целей. Некоторые из них, а именно инсулин и вазопрессин, были описаны в § 2.1. Огромный интерес к синтетическим пептидам возник, когда открыли большую группу пептидов мозга. Первыми были открыты метионин-энкефалин Туг—Gly—Gly—? he—Met и лейцин-энкефалин Туг—Gly—Gly—Phe—Leu. Эти два пептида связываются с теми же мозговыми рецепторами, что и опиаты, например морфин. Таким образом, их можно использовать вместо морфина в качестве анальгетика. Основное достоинство этих пептидов заключается в том, что опасность привыкания к ним существенно ниже, чем к морфину.

Традиционная синтетическая макромолекулярная химия обычно имеет дело с получением гомополимеров, построенных из однотипных мономерных единиц по всей цепи. Разработаны методы, позволяющие получать тысячи и миллионы тонн многих полимеров. Те же технологии позволяют в случае необходимости получать сополимеры, состоящие из двух (или более) сходных типов мономеров со статистическим распределением их по цепи. В частности, возможно получение гомополимеров или статистических сополимеров, состоящих из аминокислотных остатков, связанных между собой пептидными связями (полиаминокислот). Общей проблемой как при получении полиаминокислот, так и в синтезе нерегулярных полипептидов является образование пептидной связи. Если речь идет об образовании пептидной связи из аминокислот, то предварительно их надо прев-

283

ратить в активные производные. Это необходимо по крайней мере по двум причинам. Во-первых, образование пептидной связи в водном растворе неблагоприятно с точки зрения термодинамики, так как ее AGq > 0. Соответственно этот процесс необходимо совместить с экзэргоническим процессом с ? Go < 0, с тем чтобы суммарное значение ? G было близко к нулю, а еще лучше — превосходило по абсолютной величине значение AG образования пептидной связи. Во-вторых, и карбоксильная и аминогруппа являются нуклеофилами, так что прямое взаимодействие между ними неблагоприятно с кинетической точки зрения. Обе проблемы обычно решаются одновременно, так как превращение одной из функциональных групп аминокислот, чаще всего карбоксильной группы, в электрофиль-ное производное не только снимает кинетические затруднения, но проходит сопряженно с процессом, характеризующимся отрицательным значением AG, сообщая аминокислоте необходимое для образования пептидной связи количество свободной энергии.

В качестве примера можно привести процесс получения полиаминокислот, основанный на конденсации ?-карбоксианшдридов аминокислот (102), образуемых из соответствующих аминокислот обработкой фосгеном:

NHrCHR,C00* + COCL2

CHR?

\ /

CO—0

102

2 HCL

страница 70
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.11.2017)