Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

очень мал, а число Фрагментов, образующихся из больших молекул РНК, весьма велико. Даже если

удается их разделить и определить их первичную структуру, как правило, не удается собрать из этих данных полную исходную структуру РНК даже в случае таких сравнительно небольших молекул, как транспортные РНК. Поэтому, хотя на этом пути с некоторыми дополнительными ухищрениями и были получены первые данные о структуре рибонуклеиновых кислот, прямое секвенирование РНК имеет ограниченное применение.

Совершенно иначе обстоит дело с ДНК. У многих бактерий найдены ферменты, которые гидролизуют двунитевую ДНК по участкам, обладающим строго определенной последовательностью из нескольких нуклеотидов, чаще всего четырех или шести. Такие фрагменты встречаются довольно редко — в среднем соответственно один на 256 для фрагментов из четырех нуклеотидов или один на 4048 для фрагментов из шести нуклеотидов, т.е. фрагменты в среднем имеют значительную длину, а число фрагментов со строго определенной последовательностью не очень велико. Расщепление обеих нитей происходит по участкам, которые для большинства ферментов этой группы построены из двух идентичных фрагментов или, как принято говорить, самокомплементарны.

Например, фермент из E.coli, называемый сокращенно EcoRl, катализирует гидролиз по участкам, с последовательностью нуклеотидов G — ? — ? — ? — Т — С, причем расщепление в обеих цепях происходит между остатками G и А. Схема расщепления, таким образом, может быть записана в виде

<а')-pGpApApTpTpC—(З1) (5'1-pG-OH рАрАрТрТрС—< 3 ' )

(З1)—CpTpTp.ApApGp-( 5* ) ( J 1 )—CpTpTpApAp HOGp-(5')

Эти ферменты известны под общим названием эндонуклеазы рестрикции. Термин эндонуклеаза означает, что фермент катализирует расщепление нуклеиновой кислоты по внутренним фосфодиэфирным связям в отличие от экзонуклеаз, катализирующих отщепление концевых звеньев нуклеиновой кислоты (к их числу относится упоминавшаяся в § 7.3 фосфодиэстераза из змеиных ядов). Сокращенно эндонуклеазы рестрикции называют рестриктазами. В табл. 7.5 перечислены некоторые из наиболее широко используемых при изучении структуры ДНК и других биохимических исследованиях рестриктазы.

С помощью рестриктаз удается расщепить большие молекулы ДНК на фрагменты умеренной длины, которые, как правило, могут быть разделены электрофорезом. Совпадение длин двух фрагментов, которое воспрепятствовало бы разделению, — событие маловероятное. В том случае, если все же это происходит, следует воспользоваться ферментом другой специфичности.

Участки ДНК, по которым происходит расщепление той или иной рестрикта-зой, называют сайтами рестрикции. Поскольку эндонуклеазы рестрикции используются не только для подготовки ДНК к секвенированию, но и для других целей, в частности для генной инженерии (см. § 7.11), распределение сайтов рестрикции вдоль молекулы ДНК является важной характеристикой ДНК. Установление взаимного расположения этих сайтов называют физическим картированием ДНК, а саму схему такого распределения — физической картой ДНК *.

*Термин <физический> здесь используется просто как альтернатива <биологическому>| т.е. распределению в молекуле ДНК участков, программирующих различные гены. 276

Таблица 7.5. Некоторые рестриктазы и расщепляемые ими последовательности (стрелками показаны точки расщепления)

Микроорганизм

Сокращение

Последовательность 5' —*3' 3'-»5'

Bacillus amyloliquef aciens ? ? ВалЩ

Escherichia coli 1Y13

Haemophilus aegyptius

Haemophilus aegyptius

Haemophilus haemolyticus

Ecoll

Haell

Haelll

Hhal

Haemophilus influenzae id Hindll

Haemophilus influenzae Ed I Hindlll

Haemophilus parainf luenzae I Hpal

Haemophilus parainf luenzae I Hpall

Streptomyces albus 6

SaLI

i

GGATCC CCTAGG

i T

GAATTC CTTAAG

ri

PuGCGCPy PyCGCGPu

fi

GGCC CCGG ?

I

GCGC CGCG

' 4

GTPyPuAC CAPuPyTG

1 '

AAGCTT TTCGAA

И

GTTAAG CAATTG

if

CCGG GGCC t

i

GTCGAC CAGCTG

Прорыв в секвенировании полинуклеотидов, в первую очередь ДНК, был совершен после того, как исследователи отказались от основных канонов аналитической химии и пошли по принципиально иному пути, позволившему задачу, длительное время казавшуюся невыполнимой, превратить в рутинную процедуру.

Почти одновременно было предложено два метода, основанных на одной принципиальной идеологии, хотя резко отличающихся по своему химическому содержанию. Эти методы известны как метод Максима — Гилберта и метод Сэтера.

Первый этап метода Максама — Гилберта состоит в том, что в 5 '-конец анализируемого полинуклеотида с Рис. 77. Идеализированная схема секвени- помощью полинуклеотид киназы вводят рования ДНК в геле и определенная после- меченый остаток фосфорной кислоты довательность максимально доступной удельной ак-

тивности. В дальнейшем манипулируют со столь малыми количествами образца, что регистрации поддаются только его производные, содержащие 5 '-конец, т.е. высокорадиоактивный остаток фосфорной кислоты, а любые иные производные, если даже присутствуют, остаются немечеными и потому нетестированными (невидимыми).

На втором этапе гомогенный, меченный по 5 '-концу полинуклеотид подвергается в четырех отдельных пробах химической обработке, приводящей к специфическому или, по крайней мере, преимущественному расщеплению по одному из четырех типов нуклеотидных остатков. Используемые химические реакции приведены ниже. Существенным моментом этого этапа является проведение каждой из четырех реакций на такую глубину, что в среднем на каждую цепочку приходится один разрыв. Это нетрудно осуществить путем подбора времени реакции и концентраций используемых реагентов. В итоге в каждой из четырех проб <види-мыми> в только что упомянутом смысле этого слова остаются фрагменты исходного полинуклеотида, содержащие неповрежденный 5 -конец и обрезанные по всем мыслимым точкам, содержащим определенный тип нуклеотида.

На третьем этапе проводится электрофорез всех четырех проб в полиакрила-мидном геле. Для того чтобы условия разделения были идентичными во всех четырех пробах, пробы наносят на один гель и разделяют на четырех параллельных дорожках этого геля. Разделение, как уже говорилось в § 7.1, проходит по длине, и положение каждого фрагмента, детектируемое радиоавтографически, дает, его длину, а тем самым и положение соответствующего мономера в исходной цепи. Таким образом, на одной дорожке, если речь идет о ДНК-фрагменте, определяется положение всех остатков тимидина, на другой — всех остатков дезокси-цитидина, на третьей — всех остатков дезоксигуанозина и на четвертой — всех остатков дезоксиаденозина. В сумме это дает положение в исходном полинуклео-тиде всех мономеров, а это и означает, что определяется его первичная структура. Эта структура в один прием считывается с геля, причем при достаточной длине дорожки геля одновременно может быть определено расположение сотен мономерных звеньев. Идеализированная схема такого разделения и определяемая последовательность приведены на рис. 77. 278

Метод расщепления, используемый при секвенировании по Максаму — Гилберту, основан на реакции расщепления полидезоксирибонуклеотидной цепи по остаткам, лишенным гетероцикла, т.е. по апуриновым или апиримидиновым фрагментам. Это расщепление проходит в присутствии оснований по схеме

(здесь В ' — катализирующее основание).

Оба разрыва являются процессами ^-элиминации, т.е. элиминации радикала, находящегося в /^-положении к полярной двойной связи С=0 или к системе сопряженных связей С=С—С=0. Процесс в равной степени может проходить, если вместо альдегидной группы находится гидразонная —СН=?<—??2.

Практически для получения апуриновых и апиримидиновых сайтов в ДНК используют три типа превращений — метилирование диметилсульфатом, обработку муравьиной кислотой и реакцию с гидразингидратом. Реакция с диметилсульфатом при рН 3,5 приводит к алкилированию атома N7 остатков гуанина, которые, приобретая положительный заряд, облегчают атаку водой гликозидного атома И':

о

(т. ?)

В 66%-ной муравьиной кислоте протонируются как остатки гуанина, так и остатки аденина, в результате чего происходит апуринизация по обоим типам гетероциклов. При последующей обработке пиперидином происходит расщепление цепи в первом случае только по остаткам дезоксигуанозина, во втором — по обоим пуриновым нуклеотидам. В итоге при радиоавтографии геля на первой дорожке выявляются все остатки, соответствующие гуанинам, на второй — и гуанинам и аденинам. Очевидно, что этой информации достаточно, чтобы раздельно определить положения в цепи обоих пуриновых нуклеотидов.

Обработка гидразингидратом приводит к расщеплению пиримидинового кольца с последующим замещением остатка мочевины на остаток гидразина и изомеризацией его в гидразон: /NH,

о ¦ Г N

I

(Ш.18)

???2 ОН _ ^

_^ У CH=N—??2

о-

Реакция проходит как по остаткам цитозина, так и по остаткам тимина. Однако в щелочной среде (0,1М КОН в гидразингидрате) реакция по дезокситимидиновым фрагментам подавляется и модификация проходит только по остаткам дезокси-цитидина. Это позволяет получить картину распределения остатков обоих пири-мидиновых нуклеотидов и отдельно — дезоксицитидиновых звеньев. Этой информации достаточно, чтобы определить положение раздельно по каждому из пири-мидиновых нуклеотидов. На рис. 78 приведены радиоавтограф геля, полученного методом Максама — Гилберта, и прочитываемая по этому гелю последовательность секвенированного полинуклеотида.

Изложенный метод с точки зрения канонов классической аналитической химии противоестествен. Для установления структуры гомогенного полинуклеотида его превращают в чрезвычайно сложную смесь фрагментов. Но именно это дает возможность после проведения электрофореза с одного геля сразу прочесть структуру, состоящую из многих десятков, а в некоторых случаях даже из нескольких сотен звеньев. Это связано со спецификой объекта — биополимера, построенного из большого числа заранее изученных и не слишком разнообразных структурных элементов.

В принципе тот же подход может быть использован для уста

страница 69
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(28.06.2017)