Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

ведения всех перечисленных операций — автоматические секвенаторы полипептидов. С их помощью удается провести до 40 — 60 шагов ступенчатой деградации.

Особенно удобно для автоматизации проведение ступенчатой деградации полипептида, ковалентно привязанного к нерастворимому полимерному носителю. В этом случае на всем протяжении секвенирования исследуемый образец остается

271

Рис. 75. Схема «твердофазного» секвенировнния полипептида, на примере фрагмента, полученного расщеплением бромцианом. Зачерненный квадрат - полимерный носитель

Основные стадии: / - присоединение полипептида к носителю; 2 - пропускание раствора фенилизотиоцианата для присоединения к непротонированной ?-аминогруппе пептида; 3 - промывка бензолом и пропускание раствора cf3cooh, приводящее к отщеплению фенилтиазолина, содержащего боковой радикал аминокислоты R(l) и укороченный на одну аминокислоту пептид; 4 - промывка и перевод фенилтиазолина в фенилтиогидантоин; 5 - хроматографический или масс-спект-рометрический анализ; 6' - возврат укороченного пептида в повторение цикла процедур 2-5

в колонке, содержащей носитель, а через нее поочередно пропускают изотиоциа-нат и кислоту (например, CF3C00H). При этом исключаются какие-либо механические потери секвенируемого полипептида, чрезвычайно облегчается процедура отмывки образца от одного из компонентов перед пропусканием второго компонента. На рис. 75 представлена схема присоединения к полимерному носителю фрагментов, полученных расщеплением белка по остаткам метионина бромцианом, и последовательность операций, используемых для автоматического секвени-рования. Каждая стадия метода Эдмана по своей идеологии полностью отвечает канонам классической аналитической химии, согласно которым при невозможности идентифицировать и количественно определить вещество его следует количественно превратить в производное, поддающееся непосредственной идентификации. В данном случае на каждой стадии метода речь идет об определении природы ?-концевого аминокислотного остатка. В составе полипептидной цепи это сделать не удается и его отщепляют для последующего определения в виде тио-272

гидантоина. Попытки м f Т' . 1" (

разработать аналогичные подходы для анализа полинуклеотидных цепей не увенчались

значимыми успехами. б N ,—--t С

Завершающим этапом установления пер- « N t ( ^ вичной структуры явля-

ч с

И i-( с

ется восстановление по- г

рядка, в котором про-

секвенированные фраг- „ _„ D

Рис. 70. Возможные варианты перекрывания пептидов. Т-менты располагались в Пептиды получены расщеплением трипсином, С-химотрипси-исходном биополимере, ном. С-Пептид содержит:

Чаще всего ДЛЯ этой а. соседние пептиды т' и т"; б - пептид Т' и ?-конец пептида цели используют ПОД- Т"; в - пептид Т" и С-конец пептида ? ¦ t - С-конец пептида ? ' и ХОД, который В белковой ?-конец пептида ?"

химии известен как метод перекрывающихся блоков. Ниже излагается 'основная идея метода, которая иллюстрируется на примере восстановления полной первичной структуры из фрагментов бычьей панкреатической рибонуклеазы.

Если установлена структура всех полипептидов, полученных расщеплением исследуемого белка с помощью трипсина (далее такие полипептиды обозначаются буквой ? — от слова <трипсиновые>, tryptic), то остается определить для каждого из этих пептидов, с какими двумя Т-пептидами он соседствует с N- и С-конца. В структуре просеквенированных Т-пептидов такая информация полностью отсутствует. Однако ее можно частично, а. в ряде случаев и полностью восстановить, если располагать аналогичными данными для серии полипептидов, полученных расщеплением того же исследуемого белка по какой-либо другой группе аминокислотных остатков. Для определенности ниже речь будет идти о полипептидах, полученных расщеплением химотрипсином (пептиды группы С, chymotryp-tic).

Как видно из рис. 76, если два Т-пептида являются соседними в исходной цепи, то существует С-пептид, который либо содержит в своем составе полностью оба или один из рассматриваемых Т-пептидов, либо как минимум содержит С-концевую часть левого и ?-концевую часть правого пептида группы Т. Этот С-пептид перекрывает два соседних Т-пептида, с чем и связано название метода.

Таким образом, просматривая структуры пептидов ? и С, можно для любой пары Т-пептидов выявить, являются ли они соседями в исследуемом белке или разделены одним или несколькими другими Т-пептидами. Неоднозначность может появиться только в случае, если перекрываемый каким-либо из С-пептидов концевой фрагмент встречается у двух или нескольких Т-пептидов. Вероятность такого совпадения, как правило, невелика. Если это все же происходит, приходится прибегнуть к еще одному варианту расщепления.

В табл. 7.4 приведены структуры пептидов, полученных расщеплением рибонуклеазы с помощью трипсина и химотрипснна. Естественно, что, когда происходит разделение смеси пептидов трипсинового или химотрипсинового гидролиза-

273

Таблица 7.4. Структуры фрагментов, полученных при расщеплении панкреатической рибуноклеазы крупного рогатого скота трипсином (Т-фрагыенты) и химотрипскном

(С-фрагыенты) ^

Трипсиновые пептиды Химотрипсиновые пептиды Т-фрагмент аминокислотная последова- С-фрагмент аминокислотная последова-

тельность тельность

?? СК Ci qsY

т2 SR С2 DASV

Т3 DR Сз PNCAY

т4 FER С4 - VPVHF

т5 NLTK с5 KETAAAKF

т6 NVACK с6 STMSITDCRETGSSK?

т7 ETGSSK с7 ERQHMDSSTSAASSSNY

т8 ???,??? с8 KTTQANKHIIVACEGNPY

т9 YPNCAYK с9 CNQMMKSRNLTKDRCKPVNTF

Тю ??????? Сю VHESLADVQAVCSQKNVACKNGQTNCY

Тп NGQTNCYQSYSTMSITDCR

Tl2 PVNTFVHESLADVQAVCSQK

Tia HIIVACEGNPYVPVHFDASV

Тн QNMDSSTSAASSSNYCNQMMK

TOB, никакой нумерации, связанной с их расположением в полипецтидной цепи белка, ввести невозможно. Их нумеруют для удобства промежуточных рассуждений обычно по взаимному расположению в системе, используемой для разделения. В приведенном примере они пронумерованы в порядке увеличения длины, а при одинаковой длине — произвольно.

Очевидно, что ?-концевые группы всех Т-пептидов отличаются от ?-концевых групп С-пептидов, поскольку использованные для расщепления ферменты действуют по разным точкам. Исключение составляют пептиды, полученные из N-конца исходной цепи, они должны иметь одинаковое начало. Из рассмотрения приведенных в табл. 7.4 структур видно, что таковыми являются пептиды Т-10 и С-5. При этом пептид Т-10 входит в состав С-5, который в дополнение к Т-10 содержит остаток F (фенилаланин). Следовательно, пептид серии Т, примыкающий с С-конца к Т-10, должен начинаться с фенилаланина. Таковым в приведенной серии является только пептид Т-4, т.е. последовательность трипсиновых фрагментов с ?-конца молекулы Т-10, Т-4. Этот <двойной> Т-пептид содержит весь пептид С-5 и сверх того фрагмент ER. Следовательно, к С-5 должен примыкать пептид С-7, начинающийся с этих двух аминокислотных остатков. Следующая за аргинином основная часть пептида С-7 является ?-концевой частью пептида Т-14, который примыкает в исходной структуре к Т-4. Восстановленная таким путем ?-концевая последовательность рибонуклеазы приобретает вид Т-10, Т-4, Т-14. Последний содержит остаток тирозина (Y), т.е. точку расщепления химо-трипсином. Поэтому третий слева пептид группы С должен начинаться с последовательности CNQMMK. Это позволяет записать блок С-пептидов на ?-конце в виде С-5, С-7, С-9. Пептид С-9 содержит в своем составе сразу несколько Т^гептидов —

???

Т-2, Т-5, Т-3, Т-1, поскольку имеет в своем составе три остатка лизина и один остаток аргинина. За последним лизином в составе С-9 содержится фрагмент PVNTF, с которого начинается пептид Т-12, который тем самым следует разместить за пептидом Т-1. Дальнейшая последовательность восстанавливается на основании аналогичных рассуждений, при этом принимаем во внимание, что Т-12 содержит начало С-10; С-10 содержит целиком Т-б и начало Т-11; Т-11 содержит С-1 и начало С-б; С-б содержит целиком Т-7 и начало Т-9; Т-9 содержит С-3 и начало С-8; С-8 содержит целиком Т-8 и начало Т-13; Т-13 содержит С-4 и С-2. Таким образом, последовательность Т-пептидов и С-пептидов в исходной цепи имеет вид

ТЮ - Т4 - Т14 - Т2 - Т5 - ТЗ - ?? - Т12 - Т6 - ТП - Т7 - Т9 - Т8 - Т13 С5 — С7 — С9 — СЮ - CI - С6 - СЗ - С8 - С4 - С2

Приведенный пример является вполне <благополучным> в том смысле, что нигде не возникает неоднозначностей в принятии решения по объединению пептидов. Нетрудно, однако, убедиться, что если бы, например, в серии С-пептидов оказалось два пептида, имеющих на ?-конце дипептид ER, то осталось бы неясным, какой из них примыкает к С-концу пептида С-5. Точно так же, что еще более вероятно, если бы в серии Т-пептидов имелось два (или более) пептида, начинающихся с остатка фенилаланина, то осталось бы неясным, какой пептид примыкает к С-концу пептида Т-10. Вероятность таких совпадений повышается с ростом размера белка, чему сопутствует рост числа пептидов, образующихся при трипсиновом, химотрипсиновом или каком-либо другом специфичном расщеплении. Как уже говорилось, в этом случае приходится прибегать к большему числу вариантов специфического расщепления цепи.

7.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Аналогичные трипсину и химотрипсину ферменты, расщепляющие по мономерным остаткам определенного типа, существуют и для рибонуклеиновых кислот. К их числу относится рассмотренная ранее панкреатическая рибонуклеаза, или, как ее сокращенно называют, РНКаза А. Этот фермент специфично расщепляет РНК после остатков пиримидиновых нуклеотидов с образованием на первом этапе на образовавшемся новом 3'-конце отщепленного фрагмента 2',3'-цикло-фосфатной группы, а на 5 '-конце второго фрагмента — свободной 5 '-гидроксигруппы

№.15)

где В — урацил или цитозин.

Известен и широко используется и более избирательный фермент Т1 РНКаза, которая катализирует аналогичное расщепление после остатков гуанозина. Однако средний размер получаемых в обоих случаях фрагментов

страница 68
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(13.12.2017)