Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

что гель-хроматографию можно проводить в мягких условиях, сохраняя белок в нативном, функционально активном состоянии. Если в распоряжении экспериментатора имеется специфический тест на этот белок, пригодный для его выявления в смеси с другими белками, например определенная ферментативная активность, то определить молекулярную массу можно даже в неочищенном препарате белка, т.е. уже на промежуточных стадиях его очистки. Если полимер имеет четвертичную структуру, то, как правило, она сохраняется в условиях разделения и молекулярная масса представляет собой сумму масс составляющих белок субъединиц.

В качестве метода разделения для той же цели широко используют электрофорез в гелях. Для белков вследствие различий в их аминокислотном составе простой корреляции между молекулярной массой и подвижностью в электрофорезе не существует. Однако она может быть получена, если вести электрофорез в присутствии детергента. В биохимической практике для этой цели чаще всего используют додецилсульфат натрия C^H^sOSOaNa (sodium dodecyl sulfate, сокращенно SDS). При разделении в SDS-полиакриламидном геле происходит полная денатурация белковых молекул с выворачиванием наружу их гидрофобного ядра в результате захвата додецильных радикалов, в результате чего на поверхности образовавшегося агрегата появляется отрицательный заряд и он ведет себя в электрофорезе как полианион. Эксперимент показывает, что при этом в широком диапазоне выполняется линейная зависимость электрофоретической подвижности от логарифма молекулярной массы, которая после градуировки по белкам с известной молекулярной массой может быть использована для определения молекулярной массы исследуемого биополимера. В результате денатурации субъединичные белки диссоциируют на отдельные субъединицы, так что, во-первых, выявляется, из скольких разнотипных субъединиц состоит исследуемый белок, и, во-вторых, находится масса отдельных субъединиц.

Электрофорез в полиакриламидном геле также используется для оценки молекулярной массы нуклеиновых кислот. Применительно к таким огромным молекулам, каковыми являются даже простейшие ДНК, например ДНК не особенно крупных вирусов или митохондриальные ДНК, этот подход мало эффективен, я° он широко применяется для оценки размеров фрагментов двунитевых ДНК, на которые их разрезают на первых этапах работы по установлению первичной структуры. Этот вопрос несколько подробнее рассмотрен в § 7.8. I

7.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ

Белки и нуклеиновые кислоты при всем их неисчерпаемом многообразии построены из стандартных наборов соответствующих мономеров. Поэтому установление первичной структуры сводится преимущественно к выяснению, в каком порядке эти мономеры располагаются вдоль полипептидной или полинуклеотидной цепи. Эту задачу часто называют секвенирооанием (от англ. sequence — последовательность) .

В отдельных случаях, естественно, исследователи сталкиваются с тем, что в составе исследуемого биополимера оказываются минорные компоненты неизвестного строения. В этом случае встает задача выделения этих компонентов и установления их строения методами органической химии, причем нередко приходится ограничиваться незначительным количеством материала, исключающим на первых порах применение таких высокоинформативных методов структурного анализа, как ядерный магнитный резонанс и рентгеноструктурный анализ. При последующем изложении будут рассматриваться методы, основанные на предположении, что подобные компоненты в секвенируемом биополимере отсутствуют.

Собственно секвенирование на его сегодняшнем уровне позволяет определить последовательность аминокислот в полипептидах, состоящих не более чем из нескольких десятков аминокислотных остатков, и определить в один прием последовательность для полинуклеотида, длина которого не превышает нескольких сотен мономеров. Существенно, что названные полимерные фрагменты значительно короче, чем те природные биополимерные молекулы, структура которых подлежит определению. Поэтому перед собственно процедурой секвенирования приходится разрезать исследуемый полимер на фрагменты определенной длины, достаточно короткие, чтобы их можно было подвергнуть секвенированию. Обычно речь идет о разрезании на значительное число фрагментов, которые должны быть разделены и очищены до индивидуального состояния. После того как каждый из них подвергнут секвенированию, следует восстановить структуру исходного биополимера, т.е. определить, в каком порядке набор фрагментов с уже установленной первичной структурой располагался в исходном биополимере.

Таким образом, определение последовательности мономерных фрагментов в биополимере разбивается на три главных этапа:

1) расщепление биополимера на несколько фрагментов, имеющих длину, доступную для используемых методов определения первичной структуры, и выделение этих фрагментов;

2) секвенирование каждого из полученных фрагментов;

3) сборка полной структуры биополимера из установленных структур его Фрагментов.

Ниже последовательно рассматриваются важнейшие из используемых для этой Дели подходов.

Для специфического расщепления белков по определенным точкам применяются как ферментативные, так и химические методы. Из ферментов, катализирующих гидролиз белков по определенным точкам, наиболее широко используют трипсин и химотрипсин. Трипсин специфично катализирует гидролиз пептидных связей, расположенных после положительно заряженных аминокислотных остатков — лизина и аргинина. Химотрипсин преимущественно расщепляет белки п°сле остатков ароматических аминокислот — фенилаланина, тирозина и трипто-

¦?

фана. Механизм действия этих двух ферментов и факторы, обеспечивающие указанную специфичность гидролиза, вкратце рассмотрены в § 6.1. В ряде случаев, особенно когда этих двух ферментов по тем или иным причинам оказывается недостаточно, привлекаются и другие протеазы. В необходимых случаях специфичность трипсина может быть повышена или изменена. Например, обработка цитраконовым ангидридом исследуемого белка приводит к ацилированию остатков лизина, которые в результате этого теряют положительный заряд. В таком модифицированном белке расщепление будет проходить только по остаткам аргинина, который при этой процедуре не модифицируется. Применение цитра-конового ангидрида для ацилирования позволяет в дальнейшем, после разделения полученных полипептидов, отщепить цитраконовую кислоту мягким кислотным гидролизом. Этому способствует наличие вблизи образовавшейся амидной связи карбоксильной группы, способствующей легкому внутримолекулярному протонированию амидной группы, которое резко облегчает атаку амидной связи водой:

о

-??—сн—со-5 ^| > ??—сн—со"

(СНД ij (снд

HHt "" NH "

I

со—сн=с—соон сн3

—NH—СН—СО- ""—NH—СН—CO—-~

L (|Нг,4 ??0' "I [CH2)t + ноос—СН = С—СООН (Ш.П)

+NHj COO" NH3+ СН3

СО—СН=С

СН,

Наоборот, обработка исследуемого белка этиленимином приводит к модификации в нем остатков цистеина по реакции

¦~" NH С ?—СО- -~_??—СН—СО-

j NH ?

СН2 н2с^-Лн2 сн2 (Ш.П)

SH S—CH2CH2-NH3

в результате которой на этих остатках возникает положительно заряженная группа. Трипсин катализирует расщепление пептидных связей по заряженным амино-этилцистеиновым остаткам.

Наряду с ферментативными методами в практику белковой химии широко вошли химические методы расщепления по аминокислотным остаткам определенного типа. Среди них важнейшим является расщепление с помощью бромциана, которое проходит по остаткам метионина по схеме

-NH—СН—СО—NH—CHR—СО- —NH—СН—СО—NH—CHR—СО-

СН2 8iсн2 -вг- сн2 -.

I ? -CH,SCN

SCH3 N = c-s +

\н3

270

+ II —NH—СН—С = NH—CHR—СО- —NH—СН—С + NH3—CHR—СО-

сна-Л -М- ?2 о {шт

CHf CH2

Секвенирование полипептидов проводят методом, известным как метод Эдмана. Последовательная обработка полипептида, имеющего свободную концевую ot-аминогруппу, каким-либо алкил- или арилизотиоцианатом в слабощелочной среде приводит к образованию соответствующей тиомочевины, которая в умеренно кислой среде (при значениях кислотности, не повреждающих пептидные связи) отщепляется в виде соответствующего тиогидантоина. Оригинальная процедура Эдмана основана на использовании фенилизотиоцианата и тем самым на образовании фенилтиогидантоинов:

—NHjCHR^ONHCHRjCO—" + Ph-N=;C=S — РК— NH-C-NH-CHR,CONHCHR2CO-??

S

О

?

-~Ph-^ pHR,+nh2CHR2CO—~ ' .

В результате образуется фенилтиогидантоин, содержащий боковой радикал аминокислоты Ri, который может быть идентифицирован путем измерения какой-либо физической или физико-химической характеристики, позволяющей различать гидантоины, соответствующие разным входящим в состав белков аминокислотам. В качестве такой характеристики может служить хроматографическая подвижность в какой-либо предварительно проградуированной по стандартным образцам гидантоинов системе или молекулярная масса, определяемая с помощью масс-спектрометра.

Превращение ?-концевого аминокислотного остатка в тиогидантоин приводит к укорочению анализируемой полипептидной цепи на одно звено. Выделив этот пептид, исследователь получает возможность повторить всю процедуру, установить природу второго аминокислотного остатка и выделить полипептид, укороченный на два звена. Многократное повторение такой ступенчатой деградации дает возможность последовательно идентифицировать все составляющие исходный полипептид остатки аминокислот, т.е. установить его первичную структуру. Практически в ручном варианте метод Эдмана позволяет сделать один-два десятка шагов. Работа сводится к многократному повторению одних и тех же чередующихся процедур: добавления изотиоцианата, отщепления тиогидантоина, отделения его от укороченного пептида для последующей идентификации, выделение оставшегося полипептида в виде, пригодном для следующего шага обработки. Чтобы избавить исследователей от такой монотонной работы, требующей вместе с тем строгого соблюдения условий эксперимента на каждом шаге, созданы специальные автоматизированные установки для про

страница 67
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.09.2017)