Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

екоторую подложку (дот-гибридизация, от англ. dot — пятно). Этот тип гибридизации фактически уже описывался на примере анализа на содержание гена энтеротоксина. Разрешающая сила метода повышается, если анализируемый образец предварительно подвергнуть гель-электрофорезу. В этом случае полезно перенести материал с геля на более удобный для проведения гибридизации материал, приведя гель в контакт с целлюлозным или нейлоновым фильтром. Добавление меченых зондов позволяет обнаружить полосы, несущие определяемые последовательности. Этот метод известен как гибридизация по Сауэерну.

Одним из широко используемых применений гибридизации по Саузерну являйся метод, известный под названием RFLP (Resrtiction Fragment Length Polymorphism). В этом методе анализируемый образец ДНК подвергается обработке специфическими эндонуклеазами рестрикции (см. § 7.8), которые разрезают иссле-

?· т^^||||||||Ш1Ш11»»||||||ШШШ111111111 ilrtmil днк

денатурация нагреванием гибридизация

* праймер

¦ ДНК -полимераза

3'

. 5'

i

3'-^СШ1шТ

?'?1 5 ?-

з ¦

5'

-m б'

ЛППЩ^ч,^- з'

I

5 0 5'Q

|||||||Ш1111111ШШ111111Ш1111ШИ1Ш!

tiiiiiitmiiiiituiiiiiiiiii

ншиншшншшшш

I

¦ 5

. 5'

3'

второй пикя

3'

5'«

з;

S'i

3'

5'? 3'

5з:

5'

5' ДНК 3'

lllHIIIHilllllllllllllllllllllllllllllllll1

5" 3'

¦¦ 5' днк

3' ?· 5'

3" 5' 3"

ДНК

ДНК ДНК

20 анклав »10> молекул

Рис. 74. Принципиальная схема первых стадий процесса амплификации

дуемую ДНК по определенным точкам. После электрофореза и Саузерн-гибриди-зации получается характерное расположение полос, гибридизующихся с некоторым определенным зондом. Это расположение строго индивидуально для каждой ДНК, поскольку при изменении в какой-либо точке последовательности, узнаваемой соответствующей эндонуклеазой, размеры некоторых из фрагментов, а следовательно, и расположение полос изменяются. Это может быть использовано для идентификации людей в криминальных ситуациях, по оставленным ничтожным следам какого-либо биологического материала. Метод также полезен для выявления патологических генных мутаций.

Следует отметить, что в случаях, не требующих сверхвысокой чувствительности, ПЦР может быть использована для того, чтобы определять наличие определенных нуклеотидных последовательностей в образце без последующей гибридизации. Появление полосы определенной длины в полиакриламидном геле при электрофорезе после того, как образец был подвергнут ПЦР с определенной парой праймеров, надежно указывает на то, что выбранная последовательность действительно присутствует в образце.

Значение ПЦР не ограничивается ее применением в гибридизационном анализе. ПЦР можно использовать и в препаративных целях для накопления достаточного количества материала ддл различных научных и прикладных задач, например для получения достаточного количества ДНК-зондов.

7.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БИОПОЛИМЕРА

Существенный этап в исследовании биополимеров — определение их молекулярной массы. В отличие от химии высокомолекулярных соединений, имеющей в основном дело с полидисперсными системами и поэтому оперирующей со средними значениями молекулярных масс, биохимию в части, касающейся белков и нуклеиновых кислот, в первую очередь интересует молекулярная масса индивидуальных объектов.

Очевидно, что наиболее точным методом определения молекулярной массы индивидуального белка или нуклеиновой кислоты является установление их первичной структуры, после чего молекулярную массу получают простым суммированием ее значений для отдельных мономерных звеньев. Поскольку на сегодняшнем уровне биохимии установление первичной структуры практически всегда является одной из основных целей исчерпывающего изучения биополимера, остальные методы определения молекулярной массы применяются в основном на Промежуточных этапах исследования, а также в тех случаях, когда биополимер не Удается получить в виде индивидуального, пригодного для детальных структурных исследований вещества. В этом параграфе речь будет идти именно о таких приближенных методах, используемых на первой фазе изучения биополимера.

На ранних этапах развития биохимии белков и нуклеиновых кислот важное значение имели абсолютные методы определения молекулярной массы, т.е. методы, не привлекающие данных, полученных на других аналогичных объектах. В пастоящее время, когда в распоряжении исследователей имеется огромный материал по молекулярным массам самых разнообразных белков и нуклеиновых кислот, широкое применение нашли относительные методы, основанные на сопоставлении каких-либо легко доступных измерению зависящих от молекулярной мае-

сы характеристик исследуемого объекта с данными для биополимеров с уже известной молекулярной массой.

Среди абсолютных методов удобным и в ряде случаев несложным является метод концевого анализа. Как в белках, так и в нуклеиновых кислотах на концах имеются группы, существенно отличающиеся по своим свойствам от соответствующих групп внутренних остатков. Если провести по одной из этих групп химическое или биохимическое (т.е. катализированное каким-либо ферментом) превращение, позволяющее количественно ввести в нее некоторую метку — спектральную, флуоресцентную или радиоактивную, то тем самым можно определить число концевых групп, т.е. число молекул биополимера в образце. Зная одновременную массу исследуемого образца, нетрудно отсюда найти молекулярную массу. В белках для концевого анализа используют динитрофенильную группу, которую вводят по уникальной концевой ?-аминогруппе обработкой динитрофторбензо-лом. Введенная метка устойчива в условиях полного расщепления белка до аминокислот. Лишенная положительно заряженной в кислой и нейтральной среде а-аминогруппы динитрофениламинокислота может быть легко отделена от остальных ?-аминокислот, образовавшихся при гидролизе полипептидной цепи, а ее количество может быть измерено по характерному для динитрофенильных производных УФ-поглощению при 360 нм. Аналогично может быть использована реакция с 5-М^-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлоридом (сокращенно дан-силхлоридом), приводящая к превращению концевой аминокислоты в дансильное производное, которое может быть с высокой чувствительностью зарегистрировано по характерной флуоресценции при облучении УФ-светом с ? = 254 нм: N(CH3)2

+ NH3CHR,C0—NHCHR2CO-...

OjCL

N(CH3)2

Гидролиз

+ NH3CHR2C0O~ +...

(??.?)

S02NHCHR, CO—NHCHRjCO-..

S02NHCHR, COO"

Для рибонуклеиновых кислот характерной является цис-диольная группа на 3 '-конце олиго- или полинуклеотида. Добавление периодата натрия приводит к окислению ее до двух альдегидных групп, а последующее взаимодействие с аминами — к образованию оснований Шиффа. Последние могут быть восстановлены до стабильных алкиламинов с помощью боргидрида натрия. Все реакции протекают в водном растворе при комнатной температуре и нейтральном рН, т.е. в условиях сохранности полирибонуклеотидной цепи. Последовательность превращений может быть записана в виде

(Ш. 9)

где В — любой гетероцикл.

Если радикал R содержит спектроскопическую, поглощающую вне области поглощения РНК (т.е. при ? > 300 нм), флуоресцирующую или радиактивную метку, то процедура позволяет определить молярную концентрацию концевых групп, т.е. общее число молекул РНК, а следовательно, и молекулярную массу.

Для ДНК концевая метка может быть введена ферментативным путем. Чаще всего для этой цели используют фермент полинуклеотидкинаэу, специфически катализирующую перенос остатка фосфорной кислоты от молекулы АТФ к 5 '-гидроксигруппе 5 '-концевого фрагмента ДНК. Этот фрагмент производится в E.coli, зараженной бактериофагом Т4, который содержит ген, программирующий синтез этого фермента. Если исходная ДНК содержит в 5 '-положении остаток фосфорной кислоты, то его можно предварительно удалить с помощью другого фермента — фосфомоноэстеразы (щелочной фосфатазы), катализирующей отщепление ортофосфата от моноэфиров фосфорной кислоты. Чаще всего для этой цели используется фермент из E.coli. В целом схему введения 5'-концевой метки в ДНК можно представить следующим образом:

(ШЛИ)

(здесь Р* — радиоактивная метка, 32Р или 33Р).

Существует несколько физических методов абсолютного измерения молекулярных масс, в первую очередь основанных на использовании седиментации или рэлеевского рассеяния света. Они требуют существенно большего количества индивидуального биополимера, чем описанные химические и биохимические методы, проводятся путем прецизионных измерений на дорогостоящем оборудовании и применительно к задаче измерения молекулярных масс белков и нуклеиновых кислот постепенно утрачивают свое значение. Седиментационные методы основаны на использовании уравнений (7.2) или (7.3). В первом случае измерению подлежат константа седиментации биополимера и коэффициент диффузии. Во втором случае нужно достичь состояния седиментационного равновесия и измерить распределение концентрации исследуемого биополимера вдоль центрифужной ячейки, т.е. концентрацию биополимера на нескольких разных расстояниях г от оси ротора. Оба метода требуют определения парциального удельного объема, или, что то же самое, плавучей плотности биополимера в условиях, используемых для седиментации.

1

Наиболее употребительные относительные методы основаны на измерении подвижности биополимеров в какой-либо системе зонального фракционирования. Для нативных белков используется гель-хроматография. Из-за гетерогенности пор в таких гелях в достаточно широком диапазоне молекулярных масс объем V^, в котором выходит биополимер, возрастает с уменьшением молекулярной массы М, поскольку возрастает число пор, доступных для биополимера. При этом достаточно хорошо выполняется зависимость

Ve/VQ = A-BlgM, (7.6)

где Vo — внешний (свободный) объем геля; А и В — постоянные коэффициенты.

Проведя на колонке с гелем измерение Ve для нескольких белков с известной молекулярной массой, т.е. фактически осуществив градуировку колонки, можно определить Ve для исследуемого биополимера и путем интерполяции с помощью соотношения (7.6) найти его молекулярную массу. Существенно,

страница 66
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2017)