Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

нализируемый образец может быть закреплек на какой-либо подложке или иммобилизован в геле. Последняя ситуация довольно типична для нуклеиновых кислот, если анализируемая смесь подвергалась гель-электрофорезу. Иммобилизованный образец может быть обработан соответствующим зондом, несущим какую-нибудь метку, которая после удаления избытка зонда позволяет с высокой чувствительностью зарегистрировать образование дуплекса. Олигонуклеотидные зонды получают синтетически (см. § 7.10). ДНК-зонды могут быть получены с помощью генетической инженерии с использовани-Рис. 72. Схема введения радио- ем методов, описываемых в § 7.11. Одним из наи-активнон метки <¦ помощью ник- более эффективных путей является введение трансляции. Две вертикальные комплементарного ДНК-чррагмента в бактериофаг, черты обозначают разрыв с об- ?????/· разованнем 3 -011 и 5'-конце- содержащий одноцепочечную ДНК, например вого фосфата (ник): мутантный бактериофаг М13, несущий требуемую

/ - образование никл действием вставку. Путем размножения такого фага в клетках хозяина можно накопить его в значительном количестве. Если для детекции предполагается использовать радиоактивные зонды, то их нетрудно получить размножением фага в среде, содержащей [32Р]-ортофосфат.

Методы генной инженерии позволяют ввести ДНК-зонд в виде соответствующего двунитевого фрагмента в плазмиду. Эти плазмиды после размножения внутри бактериальных клеток можно использовать непосредственно в качестве зондов, так как, будучи расплавлены, такие плазмиды не полностью ренатурируют и содержат требуемые однонитевые фрагменты-Их также можно <вырезать> из плазмиды, используя специфические ферменты рестрикции (см. § 7.6), и пометить, используя различные химические и биохимические методы.

Одним из наиболее распространенных методов для подобных целей является

т

(31 1*1

(31 (J1

14

т

[31

m

ДНКазы 1: - выщеппение pG под действием ДНК-полимеразы I: Я -застройка бреши радиоактивным фрагментом ? *ciC. с помощью ДНК-полимеразы I м ррр dG: 4 ~ выщеппение следующего (рС) фрагмента: .3 - застройка бреши с помощью ррр dC

ник-трансляция, позволяющая ввести как высокорадиоактивные метки, так и метки для нерадиоактивного анализа. На рис. 72 представлена схема радиоактивного мечения двунитевой ДНК с помощью ник-трансляции. Двуцепочечная немеченая ДНК, одна из цепей которой должна служить зондом, обрабатывается ферментом ДНКазой I, которая вызывает разрывы в дуплексной структуре с образованием 3 '-ОН-группы на одном конце разрыва и 5 '-фосфат — на другом конце. Такие разрывы называют никами. Затем такая ДНК обрабатывается ДНК-полимеразой I из Escherichia coli в присутствии одного или всех четырех [а-32Р]-дезоксинуклеозид-5 '-трифосфатов. Из-за присущей ферменту 5 '-3 '-экзенуклеаз-ной активности (см. § 5.4) фермент последовательно отщепляет 5 '-концевые нуклеотиды в точках разрывов, а образующаяся брешь немедленно застраивается в результате ДНК-полимеразной активности. При этом радиоактивные нуклеотид-ные остатки присоединяются по 3 -ОН-группам бреши. Многократное повторение подобных событий приводит к замещению значительной части нерадиоактивных остатков радиоактивными, давая таким образом высокомеченый зонд. Ники в ходе этой операции сохраняются, но могут быть легко устранены с помощью ДНК-лигазы. РНК-зонды с высокой радиоактивностью могут быть получены путем транскрипции соответствующей двунитевой ДНК в присутствии меченых в «-положении рибонуклеозид-5 '-фосфатов.

Как и в иммуноанализе, в гибридизационном анализе в настоящее время интенсивно развиваются подходы к нерадиохимической детекции, в первую очередь на основе использования ферментов. С этой целью можно либо использовать зонды, содержащие ковалентно присоединенный фермент, либо ввести в зонд какие-либо группы, способные взаимодействовать с вспомогательным белком, конъюгированным с ферментом.

Существует ряд методов, позволяющих ковалентно связать фермент с олигону-клеотидным зондом. В качестве примера можно рассмотреть получение конъюгата олигонуклеотида-зонда с щелочной фосфатазой из кишечника теленка, уже упоминавшейся при описании иммуноферментного анализа. Из олигонуклеотида нетрудно получить производное

олигонуклеотид—4>-(0)(0")-NH(CH2)2NHC(0)(CH2)2SH

с 3 '-концевой SH-группой. В щелочную фосфатазу можно ввести некоторое число бромацетильных остатков путем ацилирования части ?-аминогрупп боковых радикалов лизина активированным производным бромуксусной кислоты, например ее ангидридом. Алкилирование SH-группы зонда бромацетильным остатком фермента приводит к конъюгату:

олигонуклеотид—•(П)(п-)-NH(CH2)2NH-С(0)(СН2)2-S-СН2С(0)—фермент

В качестве иллюстрации применения гибридизационного анализа с помощью такого конъюгата можно привести Результаты анализа серии „ _.,

g Рис. 7.1 Детекция методом молекулярной гибридиза-

териальных штаммов на ции ннличия в фекалиях пациентов патогенного штам-способность продуцировать ма E.coli. несущего ген энтеротоксина: Нтеротоксин. При ЭТОМ В „ _ радиохимический анализ: б - схема нанесения образцов

качестве ЗОН JTOR ИСПОЛЬЯОВаЛИ ( I —X ) и к* он ? г in ? --? i k' V a — iTiAnwflUT-jTMftiuri чимпно

олигонуклеотиды, комплементарные к определенным областям бактериальной ДНК, кодирующей энтеротоксин. Образцы ДНК выделялись из бактериальных штаммов, которые предполагалось исследовать на содержание гена энтеротокси-на, и иммобилизовались на нитроцеллюлозных фильтрах. Те из них, которые содержали ген токсина, при обработке конъюгатом зонд-фермент гибридизова-лись с конъюгатом и могли быть легко идентифицированы путем добавления 5-Вг-4-С1-3-индолилфосфата по появлению на фильтре характерного окрашивания. Полученные результаты как радиоактивного, так и ферментативного определения, представленные на рис. 73, четко демонстрируют, что патогенный штамм присутствует в образцах, обозначенных номерами 2, 5, 7, 8.

Для использования сэндвич-гибридизации в зонд нужно ввести специальные группы, обладающие высоким сродством к вспомогательному белку, несущему метку. Как и в иммуноферментном анализе, с этой целью часто используют биотин. Его легко присоединить к олигонуклеотидам или ввести в молекулу ДНК мягкой обработкой зонда. Например, небольшое число цитозиновых остатков можно превратить в производные, несущие алифатическую аминогруппу. С этой целью зонд обрабатывается этилендиамином или гексаметилендиамином в присутствии бисульфита натрия в соответствии с реакцией

NH(CHj) ??2

0^

+ HSOj

NH(CH2)nNH2

? ? (CH2) ???-СО-биотин

(VII.7)

Последующая обработка ?-гидроксисукцинимидным эфиром биотина приводит к образованию биотинилированной ДНК. При такой модификации у цитозина сохраняется один N.—И-фрагмент, способный к образованию уотсон-криковских пар с комплементарными гуанинами, хотя эта их способность существенно понижается. Тем не менее при низкой степени модификации и достаточно длинном зонде гибридизационная способность остается высокой. Биотинилированную ДНК в составе дуплекса, образованного зондом с мишенью, можно определить используя конъюгат стрептавидина с пероксидазой, фосфатазой или каким-либо другим ферментом.

Наряду с ферментами в гибридизационном анализе нередко применяют введение в зонд каких-либо гаптенов, например динитрофенильных остатков. В этом случае образовавшийся дуплекс можно зарегистрировать с помощью антител, специфичных к гаптену и конъюгированных с ферментом. 262

Огромным достоинством гибридизационного анализа является возможность резко повысить его чувствительность, используя способность нуклеиновых кислот к самокопированию, приводящему к существенному увеличению числа анализируемых молекул. Этот прием известен под названием амплификации. Если речь идет об определении нуклеиновой кислоты известного строения, то содержание фрагмента этой ДНК длиной в несколько сотен пар нуклеотидов в исследуемом образце можно резко увеличить с помощью ДНК-полимеразы. С этой целью к образцу добавляют синтетические праймеры, комплементарные 3 '-концам обеих нитей амплифицируемого участка ДНК, выбранных для репликации. В такой системе в присутствии дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов и ДНК-полимеразы происходит репликация ДНК, причем именно той, для которой выбраны праймеры. В результате репликации появляются две новые копии с выбранными праймерами на 5 '-концах. Процесс может быть продолжен, для чего необходимо расплавить сформировавшийся дуплекс и добавить новую порцию праймера, если он исчерпался. Последующее снижение температуры до уровня, позволяющего образование дуплекса матрица — праймер, позволяет осуществить следующий цикл репликации. Легко подсчитать, что теоретически достаточно 20 циклов, чтобы достичь увеличения количества ДНК в 106 раз. Так как ДНК-полимераза при нагревании может инактивироваться, то предпочтительно использовать специальные ферменты из термофильных организмов. В настоящее время наиболее широко применяется ДНК-полимераза из Thermus aquattcus (Taq-полимераза). В этом случае фермент выдерживает нагревание вплоть до температуры плавления и нет необходимости добавлять новые порции фермента после каждого цикла амплификации. Описанную процедуру называют цепной полимеразной реакцией или сокращенно ПЦР (от англ. polymerase chain reaction-PCR). Она позволяет повысить в миллионы раз чувствительность, открывая таким образом возможность детектирования небольшого числа полинуклеотидных цепей, например несколько частиц вируса СПИДа в исследуемой крови. Гибридизационный анализ образцов, предварительно амплифицированных с помощью ПЦР, открывает перспективу ранней пренатальной диагностики наличия дефектного гена у плода, используя в качестве анализируемого материала небольшое число клеток околоплодной жидкости. На рис. 74 представлена принципиальная схема нескольких первых стадий процесса амплификации. Аналогичным образом можно анализировать РНК, если предварительно провести обратную транскрипцию.

Наиболее простым способом гибридизации является проведение ее с образцом, нанесенным в виде пятна на н

страница 65
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.10.2017)