Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

иммунизации животных конъюгатом гаптена с высокомолекулярным носителем, способным вызывать иммунный ответ. Иммуноанализ нашел широкое применение для анализа содержания различных гормонов, что имеет огромное значение для оценки состояния эндокринной системы человека и животных. Важное значение для оценки состояния окружающей среды, в первую очередь качества питьевой воды и пищевых продуктов, приобретает иммуноанализ содержания пестицидов. В связи с интенсивным развитием гибри-домной техники для анализа определенных антигенов все более широкое применение находят моноклональные антитела.

Во всех случаях иммуноанализа первичной задачей является превращение анализируемого объекта в комплекс антиген — антитело с определением его количества. При больших количествах исходного материала и достаточно высоком содержании в нем подлежащего определению антигена или антитела можно воспользоваться тем, что образование комплекса антиген — антитело часто сопровождается его осаждением (преципитацией). В этом случае образование комплекса можно зарегистрировать по помутнению раствора (турбидиметрически). Однако развитие иммуноанализа все более смещается в область анализа малых количеств веществ, так что становится чрезвычайно актуальной чувствительность методов определения. Это достигается введением специальных меток в один из компонентов, участвующих в образовании специфического комплекса антиген — антитело. Для этой цели широко используют радиоактивные метки. Соответствующий метод называют радиоиммуноанализом. В последние десятилетия наблюдается тенденция замены радиоиммуноанализа нерадиохимическими методами детекции. Среди них наиболее широко используется иммуноферментный анализ. Он базируется на конъюгации одного из компонентов с определенным ферментом, который можно определить с очень высокой чувствительностью. Последняя достигается в результате образования огромного числа молекул продукта на каждую молекулу фермента. Одним из широко используемых с этой целью ферментов является рассмотренная в § 7.3 пероксидаза. Будучи конъюгирована с одним из компонентов специфического комплекса, она позволяет легко определить содержание к°нъюгированного с ней компонента либо по окрашиванию продукта, возникающего при добавлении Н202 и окисляемого органического субстрата, либо по интенсивности хемйлюминесценции в смеси Н202 с люминолом. Широко используется Гакже щелочная фосфатаза из кишечника теленка. В качестве субстрата в этом "¦Учае используют 5-Вг-4-?1-3-индолилфосфат, который при отщеплении фосфа-Та Дает характерное окрашивание.

Существует несколько версий проведения иммуноанализа. Наиболее очевид-""м является применение прямого количественного иммуноанализа, при котором 4Нализируемое вещество должно практически полностью перейти в комплекс.

"'ическая химия

Метка при этом должна содержаться в том компоненте, который образует комплекс с анализируемым веществом. Например, для анализа определенного антигена нужно располагать антителом, специфичным к этому антигену, ввести в него метку (радиоактивную, ферментную, люминесцентную и т.д.) и количественно перевести анализируемое вещество в комплекс. Для того чтобы достичь максимального уровня этого перехода, меченое антитело нужно брать в избытке. Но тогда нужно предусмотреть процедуру отделения комплекса от избытка меченого антитела. Для этих целей используют иммобилизацию анализируемого компонента на твердой поверхности. В этом случае комплекс антиген — антитело остается на поверхности, тогда как избыток меченого антитела, не вошедший в состав комплекса, легко удаляется.

Широко распространенная версия иммуноанализа базируется на введении метки во вспомогательный белок, обладающий сродством к комплексу антиген — антитело. В этом случае детектируется трехкомпонентный комплекс антиген — антитело — меченый вспомогательный белок. Такой комплекс часто называют сэндвичем. Одна из наиболее широко используемых систем такого рода основана на использовании витамина биотина. Биотин описан в § 4.6, и его основная биологическая функция состоит в участии в качестве кофактора в ферментах, катализирующих реакции карбоксилирования, однако наряду с этим он обладает уникальным сродством к белку авидину, содержащемуся в яичном желтке, и к его бактериальному аналогу стрептавидину. Оба эти белка являются тетрамерами, состоящими из четырех идентичных субъединиц, каждая из которых обладает активным центром для связывания биотина. Биотин может быть легко введен в антитело путем реакции его карбоксильной группы с какой-либо аминогруппой антитела. Далее для определения комплекса антиген — антитело можно использовать авидин в качестве носителя чувствительной метки, например конъюгат ави-дина с пероксидазой.

При анализе содержания в образце антител определенной специфичности можно использовать так называемый белок А из стафилококка, который обладает специфическим сродством к константной части антител в комплексе с их антигенами или гаптенами. Образование комплекса антиген — антитело регистрируется после удаления избытка антитела по взаимодействию конъюгата белка А с детектируемой меткой, например пероксидазой.

Для того чтобы продемонстрировать принцип иммуноферментного анализа, приведем результаты анализа иммуноглобулина, специфичного к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ) в сыворотке крови пациентов. Этот показатель является очень важным как минимум по двум аспектам. Применительно к человеку, укушенному клещом, результат анализа показывает, достаточно ли устойчив человек к энцефалиту. А в случае использования крови здоровых доноров этот показатель свидетельствует о том, содержит ли кровь достаточное количество антивирусных антител, для того чтобы быть использованной для приготовления антивирусного иммуноглобулина. Последний может быть использован для введения человеку, укушенному клещом, для предотвращения развития инфекции. Известно, что поверхностный вирусный белок ? является основным антигеном ВКЭ-Этот белок можно достаточно прочно сорбировать на поверхности полистироль-ной пробирки. Если взять его в избытке, достаточном для количественного связывания антител к белку ? в образце, последние будут сорбированы практически полностью. После удаления образца добавляется конъюгат стафилококкового 258

белка А с пероксидазой хрена, количество которой определяется до окрашиванию, возникающему при добавлении смеси 4-аминоантипирина и фенола. Этот анализ является типичным примером использования конструкции сэндвича, которая в этом случае состоит из антигена, специфического антитела и вспомогательного белка А, несущего метку. Меченый компонент, предназначенный для иммунохимического анализа, можно также использовать в конкурентном варианте. В этом случае метка вводится в определяемый антиген. Меченый антиген добавляется к образцу и, следовательно, разбавляется немеченым антигеном, присутствующим в этом образ-

? ??»

v.

I

I 750

500

8- 250 ч

А

эо

10 20

Время, ч

Рис. 71. Изменение концентрации мио-глобина в сыворотке крови больного при инфаркте миокарда. Существенное повышение уровня миоглобина начинается через 3-4 11 от начала приступа (кривые / и 2). Вторичный приступ вызывает повторив. Степень разбавления указывает на ное повышение уровня миоглобина (кри-количество антигена в образце. В качестве вая ^ дянньш В-В- Рошке с соя в.) примера можно привести анализ миоглобина. Этот белок находится в мышцах, включая и сердечную мышцу, и играет роль депо кислорода. Сердечная мышца повреждается во время инфаркта, и миоглобин попадает в кровяное русло. Определение количества миоглобина в крови может служить указанием на инфаркт миокарда, а измерение этого количества через определенные промежутки времени позволяет следить за течением заболевания. Один из эффективных методов такого определения был разработан на основе миоглобина, меченного 1251, путем обработки белка иодированным реагентом Болтон — Хантера

125j/

2СН2—С(0)—о-

-N

100

который ацилирует лизиновые ?-аминогруппы белка. Добавление к анализируемому образцу крови пациента приводило к разбавлению тем более сильному, чем больше было количество миоглобина в образце. По завершении образования комплекса миоглобина и его радиоактивного производного к пробе добавляли в ненасыщающих количествах антитела к миоглобину, что приводило к осаждению лишь части миоглобина, причем как нативного, так и меченого. Очевидно, что чем больше миоглобина было в анализируемом образце, тем меньшая доля от Всего миоглобина, а следовательно, и тем меньшее количество радиоактивного материала попадало в выпавший осадок. Определение радиоактивности осадка позволяло с помощью заранее построенных калибровочных кривых определить содержание миоглобина в пробах и проследить за накоплением миоглобина у пациента с предполагаемым инфарктом. На рис. 71 представлены результаты подобного анализа во время развития инфаркта. В этом случае отчетливо наблюдались две стадии развития болезни.

9'

259

7.5. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ И АМПЛИФИКАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

(5) d(...pTpCpGpGpCpT...j {У) ??-????????????...)"

(51 d(...pTpCpG|pGpCpT...) (3) d(...pApGpC pCpGpA...)

(51 d(...pT pCpG pCpT...) (3) d(...pApGpCpCpGpA...)

(51 d(...pTpCpGPG||pCp T...) (3) d(...pApGpCpC pGpA...)

(51 d(.-.pTpCpGpG pT...J (3'J d(...pApGpCpCpGpA...)

(5) d(...pTpCpGpGpCfpT...] (3) d(...pApGpCpCpG pA_.)

Подобно тому, как в иммунохимических методах наличие определенного антигена в анализируемом образце определяется по взаимодействию с антителом, специфичным к этому антигену, присутствие в образце, содержащем нуклеиновые кислоты, определенной нуклеотидной последовательности может быть зарегистрировано с помощью олигонуклеотида или нуклеиновой кислоты, комплементарных анализируемой последовательности, путем регистрации образовывания дуплекса. Соответствующие нуклеиновые кислоты или олигонуклеоти-ды обычно называют олигонуклеотидными зондами или полинуклеотидными зондами (ДНК-зонды или РНК-зонды). Метод анализа, основанный на гибридизации с такими зондами, называют гибридиэа-ционным анализом. А

страница 64
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.10.2017)