Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

которая в случае аденина может быть записана в виде

Аминокислоты могут быть превращены во флуоресцирующие производные обработкой ?-фталевым альдегидом в присутствии меркаптоэтанола по реакции

SCH2CH2OH

(^JJ^ + HS— CH2CH2OH+NHjCHRCOOH—(^J^N—CHRCOOH+2H20 (Ш.З)

Это превращение используют в настоящее время при анализе аминокислотного состава белков вместо описанной выше обработки нингидрином.

В некоторых системах испускание происходит в результате образования молекул продукта реакции в электронно-возбужденном состоянии. Примером такой реакции, нашедшей практическое применение при биохимическом анализе, является катализируемое пероксидазой окисление люминола пероксидом водорода по реакции

Н202 пероксидаза

k\ jL Js- + "* + hu (??·4)

3-аминофталат

такое свечение называют хемилюмиНесценцией.

Наконец, известны отдельные процессы испускания света, происходящие в живых организмах — светящихся бактериях и светляках. Это явление называют биолюминесценцией. Примером такой реакции является катализируемое люцифе-разой из светляков окисление люцифериладенилата (8) (см. § 2.1). Поскольку образование люцифериладенилата требует участия АТФ, интенсивность свечения связана с количеством АТФ в образце. Это открывает возможность измерять количество АТФ в образце по уровню биолюминесценции с исключительно высокой чувствительностью (до Ю-18 моль).

Важной характеристикой методов детекции является их селективность. Большие возможности повышения селективности описанных выше методов открывает Использование ферментативных реакций. Следует рассмотреть два основных случая. Первый — это определение присутствия и количества фермента по его Ферментативной активности, например его содержания во фракциях по ходу вЫделения. Очевидно, что регистрация ферментативной активности в некоторых Фракциях дает существенно более значимую информацию, чем простое определе-Ние присутствия белка, даже если обнаруживаемый фермент обладает специфическими особенностями, например является флавопротеином с характерным для Флавиновых нуклеотидов спектром поглощения. Такое поглощение будет наблюдаться и в случае смеси нескольких флавопротеинов с разными биологическими Функция ми. В большом же числе случаев фермент состоит только из белка и по своим спектральным характеристикам существенно не отличается от других бел-' °?? находящихся в этом же самом материале. Таким обиазом. только способность

Номера фрициИ

Рис. 70. Хроматограмма ядя среднеазиатской гюрзы:

/ - концентрация белка (УФ-поглощение при 280 нм); 2 - активность фосфодиястеразы; 3 - активность 5-нуклеотидазы (по данным Г.Т. Бабкиной, С.К. Василенко)

катализировать определенную ферментативную реакцию может служить доказательством присутствия фермента в анализируемом образце. Естественно, этот критерий необходимо использовать с осторожностью, так как в образце может присутствовать ряд ингибиторов или могут отсутствовать активаторы, необходимые для проявления ферментативной активности. В этом случае необходимо искать дополнительные тесты. Существенным преимуществом определения ферментативной активности является чувствительность этого метода, так как каждая молекула фермента способна превратить в продукты тысячи и даже миллионы молекул субстрата. Например, в начале этого параграфа показано, что в кювете объемом 1 мм3 можно зарегистрировать 10~12 моль NAD-?. Таким образом исследуемый фермент, если он катализирует окисление определенного органического вещества с помощью NAD* с каталитической константой порядка 103 с"1, за полчв-са (т.е. за 1800 с) способен накопить необходимое количество NAD-? при наличия порядка 10~18 моль фермента в образце. Для фермента с молекулярной массой 10s это означает возможность регистрации 10~13, или ОД пкг, фермента.

В качестве примера на рис. 70 представлен профиль элюции ионообменной хроматографии змеиного яда из Viper a lebetina (гюрзы). Как и все змеиные яды, он представляет собой сложную смесь белков. Профиль элюции белка получали измеряя оптическую плотность при 280 нм, характерную для белков, так 254

как триптофановые остатки являются основными фрагментами, отвечающими за УФ-поглощение. Параллельно измерялась активность двух ферментов во всех фракциях. Активность фосфодиэстеразы змеиного яда, катализирующей отщепление 3 '-концевых нуклеотидов от нуклеиновых кислот, определялась по количеству окрашенного в желтый цвет и-нитрофенолята, отщепившегося от Са-бис л-нитро-фенилфосфата, который является субстратом фосфодиэстеразы. Другой фермент, 5 '-нуклеотидаза, катализируя отщепление неорганического фосфата от нуклео-зид 5 '-фосфатов, приводит к накоплению фосфата, количество которого легко определяется по интенсивности сине-фиолетового окрашивания, возникающего при добавлении раствора молибдата аммония в 5 н. серной кислоте.

С другой стороны, ферменты открывают возможность анализировать с высоким уровнем специфичности присутствие определенных соединений в биологических образцах. В специальных книгах, посвященных проблемам медицинской биохимии, можно найти ряд важных биохимических критериев, необходимых для диагностических целей, в первую очередь анализов крови. В качестве примера можно привести ферментативное определение глюкозы. Содержание глюкозы в крови является важным показателем состояния организма, особенно в случае диабета. Основная задача заключается в том, чтобы отличить глюкозу от других моносахаридов и превратить ее в производное, легко определяемое фотометрически. Одна из наиболее распространенных систем состоит из двух ферментов: глю-козооксидазы и пероксидазы из хрена. Первый, будучи флавопротеином, катализирует превращение глюкозы в глюконолактон: НО—? Н0-

(Н, ОН) +

ин 1,0 он

Наличие Н2О2 можно легко регистрировать с помощью катализируемой пероксида-зой реакции с некоторыми органическими веществами, которые, окисляясь Н2О2, дают окрашенные продукты. Например, в качестве субстрата пероксидазы широко используется смесь 4-аминоантипирина и фенола, которые образуют оранжево окрашенный аддукт (99):

^?-СНз + <^ ^>—0Н + Н202

С6Н

6П5

^ /N-CH-,

99 С6Н5

Ожно также определить содержание пероксида водорода по интенсивности ^милюминесценции, возникающей в результате описанной выше реакции при Добавлении люминола.

псе

В этих случаях, очевидно, не происходит увеличение количества конечного детектируемого вещества или аддукта и чувствительность метода не превышает традиционные методы. В то же время использование фермента, строго специфичного для /J-D-глюкозы, делает определение весьма селективным.

В заключение следует сказать, что сейчас активно развивается новая область биохимического анализа — трансформация результатов биохимического процесса в физический ответ с помощью соответствующих специальных устройств. Подобные устройства называют биосенсорами. Например, ответом на определенное биохимическое событие может быть изменение потенциала некоторого электрода. Так, углеродный электрод, покрытый пероксидазой, может посылать электроны к Н2О2, который восстанавливается в соответствии с уравнением

Н202 + 2е + 2Н+-»2Н20

Процесс сопровождается существенным изменением потенциала, которое легко можно измерить и соотнести с концентрацией Н202. Следовательно, если подобный электрод обработать и глюкозооксидазой и пероксидазой вместе, то он будет <отвечать> на присутствие глюкозы, так как последняя будет окисляться кислородом, давая Н202 в соответствии с уравнением (IV.3).

Возможно использование и других типов физических ответов. Например, для реакций, сопровождающихся образованием или расходованием 02, могут быть сконструированы оптические биосенсоры. В качестве примера такого сенсора может служить концевая часть оптического волокна, покрытая двойной пленкой, состоящей из флуоресцирующего порфиринового красителя, заплавленного в полистирол, и соответствующей оксидазы, например глюкозооксидазы. По оптическому волокну к исследуемому образцу, в который погружен биосенсор, подводится возбуждающее излучение и* по нему же отводится к флуориметру испускаемое излучение. Интенсивность флуоресценции порфирина понижается в присутствии 02, и таким образом, может быть соотнесена с концентрацией 02 в слое, находящемся в непосредственном контакте с биосенсором. Расход 02, обусловленный присутствием окисляемого соединения, приводит к уменьшению концентрации Ог в слое, прилегающем к пленке, содержащей порфирин, воздействуя таким образом на интенсивность флуоресценции.

7.4. ИММУНОАНАЛИЗ

Иммуноглобулины из-за своей поразительной специфичности стали исключительно важным инструментом биохимического анализа. Методы, основанные на образовании комплексов антител с антигенами или гаптенами, называют иммуно-анализом. Иммуноанализ используется либо для определения определенных антигенов с помощью специфических к этим антигенам антител, либо, наоборот, Дия детекции антител определенной специфичности с помощью соответствующих антигенов. И та, и другая задача имеет широкий спектр применений в фундаментальных биохимических исследованиях, в биотехнологии, в медицинской практи-

живом организме имеет пре*'

ке и для оценки состояния окружающей среды.

Выявление присутствия определенных антите де всего значение для решения ряда медицинских задач. Присутствие антител ¦¦ определенным вирусам или микроорганизмам и их количество являются важ критерием наличия или, наоборот, отсутствия у организма иммунитета к соот

ствующим заболеваниям, свидетельствует о присутствии в организме соответствующего возбудителя заболевания. Например, наличие в сыворотке крови некоторых людей антител к возбудителю СПИДа, вирусу ВИЧ-1, указывает на зараже-яие человека приобретенным синдромом иммунодефицита, что является первым сигналом об инфицировании данного человека задолго до того, как появятся клинические симптомы СПИДа.

Чрезвычайно широкий спектр применений имеет иммуноанализ для определения как самого факта присутствия, так и измерения количества антигенов, в том числе гаптенов, т.е. низкомолекулярных соединений, к которым можно получить антитела, как правило, путем

страница 63
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(12.12.2017)