Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

озин 275 1,4· 103 7,1-10-8 7,1 - Ю-11

NAD* 259 18,0·103 5,5-10-9 5,5-10-12

NADH 340 6,22· 103 1,6-10"9 1,6· 10"12

Хлорофилл а 660 ' Г,4-104 - 9,1-104 1,19-10"9 1,19· 10"12

Хлорофилл b 660 t 1,7-ИИ -5,1·ПИ 1,95· ??"9 1,95-10-!2

мономерное звено биополимера, то для многих целей удобно расчет вести не на моль биополимера, а на моль мономерных-звеньев. Это относится к спектрофото-метрическому определению нуклеиновых кислот в области 260 нм, в которой поглощает каждый гетероцикл, и к определению белков в области 200 нм, в которой поглощает каждая пептидная связь. В средней УФ-области у белков поглощение происходит в первую очередь за счет остатков триптофана и в меньшей мере за счет остатков тирозина, число которых в составе полимерной молекулы невелико и резко варьирует от белка к белку. Поэтому при использовании этой области для спектрофотометрической детекции белков целесообразно пользоваться молярными величинами для биополимера в целом. Максимум поглощения у триптофансодержащих белков находится вблизи 280 нм. Поэтому иногда соотношение поглощения фракции при 260 и 280 нм используют для того, чтобы оценить, какая группа биополимеров — белки или нуклеиновые кислоты — преобладает во фракции.

Чувствительность спектрофотометрического метода, как видно из формулы (^¦5), существенно зависит от молярной экстинкций анализируемого вещества и 07 геометрических параметров кюветы. Современные спектрофотометры позволя-101 с удовлетворительной степенью точности регистрировать оптические плотнос-ти порядка 0,1. Поэтому на серийных приборах с кюветами емкостью порядка ' см3 и длиной пути светового пучка 1 см для веществ с молярной экстинкцией ПоРядка ЮЧМ"1 •см'1 может быть детектировано 10'8 моль вещества. Для нуклео— тНдов и н^клеотидных фрагментов в составе нуклеиновых кислот, имеющих молекулярную массу в пределах 300-400, это означает возможность детектировать Несколько микрограммов нуклеотидного материала. На микроспектрофотометрах

249

класса отечественных приборов <Милихром> с объемом кюветы 1 мкл и длиной пути светового пучка 1 мм, которые могут регистрировать оптическую плотность порядка 0,01, чувствительность на три порядка выше, т.е. применительно к ну-клеотидам и нуклеиновым кислотам достигает нескольких нанограммов.

Вещества, не обладающие поглощением в удобном для измерений спектральном диапазоне, могут быть окрашены с помощью специальных химических превращений. Наиболее широко известный в биохимии пример такого рода — превращение аминокислот в синий краситель путем обработки нингидрином (трикето-гидриндегидратом). Стехиометрическое уравнение реакции записывается в виде

Эта реакция широко применяется в анализе аминокислотного состава белков. Для этой цели белки подвергают расщеплению до аминокислот путем кипячения в течение 20 ч с б н. НС1. При такой обработке повреждаются триптофан и амиды

дикарбоновых кислот, которые гидролизуются до ??4 и свободных кислот. Далее проводят их хроматографическое разделение, причем для выявления зон, содержащих аминокислоты, хроматограмму прокрашивают нингидрином. Эти операции могут проводиться на специальных приборах — аминокислотных анальг заторах. В этом случае полученный гидролизат наносят на хроматографическую колонку и затем элюируют по стандартной программе, обеспечивающей разделение всех аминокислот, входящих в состав белков. Перед регистрацией выходящего элюата к нему примешивают нингидрин и смесь пропускают через специальный термостат, время прохождения через который и температура подобраны таким образом, чтобы процесс (VII.1) полностью завершился. После выхода из термостата окрашенные зоны проходят через кювету фотометра, в котором проводится количественное измерение содержания красителя, а тем самым и содержания аминокислоты. Так как каждая аминокислота в этой системе имеет определенное время выхода из колонки, то идентификация аминокислот, соответствуй щих окрашенным зонам, не вызывает затруднений.

Чрезвычайно широко при исследовании компонентов живой материи, в тон числе биополимеров, применяются радиохимические методы. В ходе фракционирования биологического материала они могут быть применены, если живые орга-низмы выращивались на среде, содержащей радиоактивные предшественники биополимеров, получали их в составе продуктов питания или при инъекция" Используют главным образом изотоп водорода 3Н (тритий), изотоп углерода изотопы фосфора 32Р и 33Р, изотоп серы 35S. Два важнейших биогенных элемента -азот и кислород — имеют изотопы 13N и 150, распадающиеся с испускание" позитронов. Так же распадается и изотоп углерода UC. Они являются персп*' тивными для использования в позитронной томографии, основанной на введеви11 изотопов в живые организмы и обнаружении и локализации их в организме по 1 излучению, возникающему при аннигиляции позитронов и электронов. ПосколЬ ку время полураспада всех этих изотопов измеряется минутами, работа с ИИ*"1

требует специальной биохимической техники, позволяющей получить из них необходимые предшественники и ввести в организм за весьма короткое время. Однако перспективы использования таких ультракороткоживущих радиоактивных изотопов в биологии и медицине настолько заманчивы, что ведется работа, нацеленная на разработку соответствующей высокоавтоматизированной биохимической и радиологической аппаратуры и соответствующих процессов, и уже сделаны первые существенные шаги в этом направлении.

Чувствительность радиохимических методов непосредственно связана со скоростью радиоактивного распада используемых изотопов, которую чаще всего характеризуют периодом полураспада . Из основного уравнения радиоактивного распада

-dn/di = kn,

где ? — число радиоактивных атомов в образце; к — константа скорости распада, связанная с периодом полураспада соотношением к — 0,693/?. , , следует, что

/2

число радиоактивных атомов в исследуемом образце при регистрируемом с помощью счетчиков радиоактивности числе распадов в единицу времени |dn/d<| составляет

? = 1,3*,, |dn/d<|. /2

Так как современные счетчики радиоактивности надежно регистрируют небольшое число распадов в секунду, то чувствительность радиохимической детекции, т.е. минимальное число атомов радиоактивного материала, которое может быть с удовлетворительной точностью измерено радиохимически, имеет порядок 1(Иу . Например, для изотопа фосфора 32Р, имеющего период полураспада 14,5 сут, эта величина составляет 107 атомов, т.е. порядка 10"п моль. В табл. 7.3 приведены периоды полураспада, тип и энергия радиоактивного излучения и '.'йсло надежно регистрируемых молей для перечисленных выше изотопов. Для нуклеиновых кислот, у которых в пределе может содержаться по одному атому 32Р на каждое нуклеотидное звено, можно детектировать до 10"13 г вещества.

Таблица 7.3. Периоды полупаспап* —

Изотоп Испускаемое излучение Период полураспада I 1 i Е, МэВ Количество изотопа, соответствующее

ч ? л -- 5770 лет 0,156 10 расп/с, моль А ОП ??-1*>

35S ? 12,26 > 0,0186 4,ОУ' IQ 12 ? ?7 1Л-1С

32р ? 86,7 сут 0,167 У>0/ · 10 15 1 fil.i п-\й

эзр ? 14,3 > 1,71 ?,?? · 10 **> О ?? . 1 ?-1 7

125J ? 25 > 0,25 ?,??* 10 1 * С\ ОО 1 ?-1 7

131J 7 а ~ 57,4 > 0,035 0,22· 10 1' 1 ? Qfl . 1 ?-17

Р> 7 8,05 > Щ0) 0,36(7) 1,68-Ю-"1

В некоторых случаях удается подобрать для детекции систему, которая испускает свет в видимой или ультрафиолетовой области. Методы, основанные на измерении испускания света, называют люминесцентными методами. При достаточно высокой интенсивности свечения люминесцентные методы по чувствительности существенно превосходят спектрофотометрические, поскольку при этом измеряется абсолютная интенсивность испускаемого света, в то время как при спектрофотометрии определяется уменьшение интенсивности пучка света в результате прохождения через исследуемый образец, которое при низких концентрациях поглощающего вещества является малой разностью больших величин.

Наиболее широко распространены флуориметрические методы, основанные на измерении флуоресценции. При поглощении ультрафиолетового или видимого излучения молекулы переходят в электронно-возбужденное состояние. Полученная энергия может полностью переходить в энергию теплового движения, а может с определенной вероятностью (квантовым выходом) испускаться в виде рассеянного электромагнитного излучения, как правило, с частотой, меньшей частоты возбуждающего излучения. Это рассеянное излучение называют флуоресценцией. Его интенсивность можно измерить с высокой чувствительностью в любом направлении, даже отличающемся от направления пучка возбуждающего излучения, лучше всего в перпендикулярном ему направлении. При использовании достаточно чувствительных фотоэлектронных умножителей это позволяет регистрировать концентрации флуорофоров, практически недоступные спектрофотомет-рическому методу. Для веществ с достаточно высоким квантовым выходом флуоресценции удается регистрировать концентрации флуорофора порядка Ю-10 ? и ниже.

Использование флуорометрических методов ограничивается тем, что далеко не все поглощающие ультрафиолетовое излучение вещества являются достаточно эффективными флуорофорами. Тем не менее среди них находятся такие аминокислоты, как триптофан и тирозин, в результате чего флуоресцируют все содержащие их белки. При облучении светом длиной волны 280 нм, т.е. в максимуме поглощения остатков триптофана, наблюдается флуоресценция с максимумом

испускания при 348 нм.

Сильным флуорофором является восстановленное никотинамидное кольцо, в результате чего интенсивной флуоресценцией обладает NADH, у которого максимум поглощения и максимум испускания находятся соответственно при 340 и 450 нм.

Широко используется в аналитических целях введение флуоресцирующих групп в различные мономеры и биополимеры. Например, остатки цитозина и аденина в составе нуклеиновых кислот и нуклеотидов могут быть превращены в интенсивно флуоресцирующие этенопроизводные обработкой хлор- и бромаце-тальдегидом по реакции,

страница 62
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.06.2017)