Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

т двумерные системы разделения на пластинках. При этом разделяемую смесь в виде пятна наносят на один из углов и разделяют в одном направлении. Затем

244

I

+

L7

и«пр««лени«

с; St

S2

О

L9a

U

о

L3." L1<—,V / S3 L2

? ? "4/ ' > ??

L10O ,?, fe" L6j.,4

ssH,r

.03

S|0 U39#^frrL19

S16 5 7 7!?520 L26 L29°L270 oL28

L30 · ^S21

'·;LЗ, oL33 L32°°

----1

Рис. 69. Двумерный электрофорез в полиакрилимидном геле при рН 8,2 (1-е направление) и при рН 4.0 (2-е направление) смеси белков, выделенных из рибосом E.coli (по данным Г.Г. Карповой):

о — фотография геля после окрашивания красителем: б - схема расположения пятен рибосомных бе.чков в геле

какие-либо параметры, определяющие разделительную способность системы, изменяют и проводят разделение в перпендикулярном направлении. При удачном подборе системы и условий разделения удается разделить те компоненты, которые не разделились при первой процедуре. Комбинации методов могут быть Довольно разнообразны: двумерная хроматография с использованием в разных направлениях различных элюентов, хроматография в одном и электрофорез в Другом направлении или, наконец, электрофорез при различных значениях рН в обоих направлениях. При этом исходное пятно разделяется на систему пятен. В качестве примера на рис. 69 приведен результат двумерного электрофореза смеси °^1ков, выделенных из рибосом Е. coli, когда в одном эксперименте разделяются Всб 53 белка, входящие в состав этого нуклеопротеида.

245

7.2. АФФИННЫЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БИОПОЛИМЕРОВ

Несмотря на многообразие и высокую разделяющую способность методов описанных в § 7.1, они оказываются бессильными при решении задач по выделению индивидуальных компонентов из сложных биологических смесей. Уже отмечалось, что иммуноглобулиновая фракция сыворотки крови состоит из тысяч различных антител, которые весьма сходны по общей структуре, что не дает надежды разделить смесь на индивидуальные компоненты традиционными методами, основанными на различиях тех или иных физико-химических характеристик компонентов. Единственным заведомым отличием каждого индивидуального иммуноглобулина является его специфичное сродство к определенному антигену. То же самое имеет место в случае смеси мРНК, которые несущественно различаются по нуклеотидному составу. Тем не менее они имеют различные нуклеотид-ные последовательности и соответственно могут обладать селективным сродством к олигонуклеотидам или нуклеиновым кислотам с комплементарными последовательностями.

Методы разделения, основанные на использовании специфичного сродства биополимера к определенному партнеру, получили название аффинных методов разделения (от англ. affinity — сродство). Наиболее широко используемый вариант аффинных методов — это использование аффинных сорбентов. Специфические лиганды ковалентно присоединяются к соответствующему носителю, и выделяемое вещество либо адсорбируется таким сорбентом, либо отделяется от остальных компонентов с помощью аффинной хроматографии с использованием того же аффинного сорбента. Разнообразие мыслимых аффинных сорбентов неисчислимо, и практически невозможно приготовить все сорбенты в коммерчески доступном виде. Оптимальным для большинства задач является наличие носителя с реакционноспособными группами, который по усмотрению исследователя может быть использован для присоединения соответствующего лиганда, подходящего для решения поставленной задачи по разделению. Количество подобных реакци-онноспособных носителей весьма велико. Наиболее популярной является бромци-ансефароза, представляющая собой сефарозу, обработанную BrC^i, который реагирует с гидроксигруппой сефарозы, превращая ее в остаток цианата:

НО ?^/?)-0??

V

I -г" BrCN-> ^

+ Br" + Н4

Такое производное активно по отношению к любым полимерам и низкомолекулярным соединениям, содержащим аминогруппу, образуя соответствующее производное:

п-- А-С—ГШ

j +??2?-> j nh;

Эта реакция может происходить с различными аминами — с ?-аминогруппами остатков лизина в белках, с аминогруппами гуанина, аденина и цитозина в нукле-

246

отидах и нуклеиновых кислотах. Присоединение лигандов к носителю обычно называют иммобилизацией.

Можно использовать иммобилизацию субстратов для выделения соответствующих ферментов или групп ферментов. В случае субстратов с низкой молекулярной массой, для того чтобы исключить стерические помехи носителя, вводятся спейсерные фрагменты между носителем и субстратом. Так, для того чтобы выделить ферменты, обладающие сродством к остатку AMP различных коферментов, могут быть использованы производные следующей структуры:

носитель

с силикагелем в качестве носителя. Используется достаточно длинный спейсер (СН2)3—0-(СН2)2-??-(СН2)б-, присоединенный к 6-NH2 аденина. Этот сорбент способен удерживать на колонке различные ферменты, взаимодействующие с ATP, NAD, NADP и др. Специфичность сорбента может быть повышена использованием NAD вместо AMP в качестве аффинной группы. Дальнейшее увеличение селективности может быть достигнуто подборкой соответствующего элюента. Так, сродство лактатдегидрогеназы к такому сорбенту может быть повышено присутствием в элюенте пирувата — второго субстрата фермента. Этот фермент катализирует реакцию

NAD+ + СН3СН0НС00- ^ NAD-? + СН3С(0)С00" + Н* лактат пируват

Присутствие пирувата увеличивает стабильность комплекса фермента с иммобилизованным коферментом, повышая сродство лактатдегидрогеназы к этому сорбенту по сравнению с другими NAD-зависимыми ферментами. Подобный метод называют аффинной элюцией.

Иммобилизация нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов позволяет получить сорбенты, способные селективно связывать определенные нуклеиновые кислоты, обладающие комплементарными последовательностями, или белки, обладающие сродством к нуклеиновым кислотам — к молекуле целиком либо ее части. Напри-МеР, олиго (с1Т)-сефароза широко используется для извлечения эукариотических М^НК из смеси нуклеиновых кислот, так как они имеют поли(А)хвосты на ^ -конце полинуклеотидной цепи. После образования комплементарных комплек-Сов с иммобилизованным олиго(с1Т) и отделения всех других компонентов смеси Зти мРНК могут быть легко элюированы после повышения температуры выше т°чки плавления соответствующего дуплекса.

247

Важной группой аффинных сорбентов являются иммобилизованные антитела, или антигены. В первом случае сорбенты могут быть использованы для специфического выделения определенных антигенов, или гаптенов, из сложных смесей. В этом случае эти сорбенты называют иммуносорбентами. Во втором случае иммобилизованные антигены способствуют выделению антител с определенной специфичностью из сложной смеси антител.

В заключение следует отметить, что аффинные методы разделения в ряде случаев оказываются более эффективными для решения задач, в принципе доступных традиционным методам, поскольку позволяют уменьшить число стадий, а в отдельных случаях провести выделение необходимого компонента в одну стадию.

7.3. МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ БИОПОЛИМЕРОВ

Как при выделении и очистке биополимеров, так и при проведении разнообразных исследований необходимо количественное определение содержания биополимера в полученной фракции, в выделенном или исследуемом образце. Во введении к этой главе уже указывалось, что биохимические исследования проводятся, как правило, с очень небольшим количеством материала и поэтому требуют высокочувствительных методов детекции. Наиболее широко распространенные методы детекции основаны на измерении оптического поглощения (спектрофотометрия), радиоактивности (радиохимические методы) или свечения образцов (люминесцентные методы).

Спехтрофотометрические методы применимы в тех случаях, когда детектируемые вещества обладают характерным спектром поглощения в видимой или ультрафиолетовой области. В табл. 7.2 приведены характерные максимумы поглощения для компонентов нуклеиновых кислот (максимальные поглощения для компонентов ДНК и РНК близки), для аминокислот, поглощающих в средней УФ-области спектра, и некоторых упоминавшихся в тексте низкомолекулярных соединений. Приведенные значения молярных экстинкций для аминокислот и нуклеотидов дают представление о порядке величин молярных экстинкций биополимеров, поскольку эти значения варьируют в составе биополимеров в не очень широких пределах. При применении спектрофотометрического метода для детекции биополимеров по ходу фракционирования следует иметь в виду, что в используемых водных растворах практически всегда присутствуют различные низкомолекулярные соединения, в первую очередь вспомогательные электролиты, вводимые для создания нужных значений рН и ионной силы. Эти соединения должны быть прозрачны в области поглощения, используемой для детекции выделяемых биополимеров, тем более что концентрация вспомогательных веществ нередко на несколько порядков превышает концентрацию биополимеров.

Если поглощение растворителя при используемой длине волны отсутствует, то количество анализируемого вещества находят по формуле

? = ??/(??), (7.5) где А — измеренная оптическая плотность; V — объем измеряемой пробы; ? " молярный коэффициент экстинкций; ? — длина пути светового пучка через кю»^ ту.

Если измерения проводятся в области спектра, в которой поглощает кажД0*

248

Таблица 7.2. Молярная экстинкция в максимумах поглощения для компонентов нуклеиновых кислот, аминокислот, пептидной связи и некоторых других низкомолекулярных соединений и чувствительность их шектрофогометрического

определения

Название соединения ^maxi нм Молярная экстинкция при рН 7 и 25° С, м-1-cM-i Количество вещества, моль, соответствующее оптической плотности 0,1 в кювете объемом 1 см3 1 мм3

Аденозин-5-монофосфат 259 15,4-103 6,49 ·10"9 6,49-10'12

Гуанозин-5-монофосфат 252 13,7· 103 7,20-10"9 7,20-10"12

Цитидин-5-монофосфат 272 9,0-103 1,1· 10"8 1,1-10'и

Уридин-5-монофосфат 261 10,0· 103 1,0-10-8 1,0· 10"11

Тимидин-5-монофосфат 267 9,6· 103 1,04-Ю"8 1,04-Ю-11

Триптофан 280 6,0· 103 1,6-10-8 1,6· Ю-11

Тир

страница 61
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2017)