Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

сегда перемещающихся в направлении катода, так и к белкам, которые при значениях рН, отличающихся от их изоэлектрической точки, несут положительный или отрицательный заряд и в соответствии с ним перемещаются в направлении одного из электродов. Изменяя рН, можно изменять в широком диапазоне заряд белковых молекул, и поэтому белки, не разделяемые в электрофорезе при одних значениях рН, могут оказаться эффективно разделяемыми При других.

Электрофорез в растворе пока имеет весьма ограниченное применение, поскольку разделяемые по ходу электрофореза зоны, во-первых, подвергаются диффузионному размыванию, а во-вторых, что более существенно, размываются конвекционными токами, возникающими в результате незначительных неоднороднос-тей температуры в системе, при ничтожных механических воздействиях и т.п. В настоящее время, по-видимому, начинается второе рождение этого метода в связи с возможностью проведения электрофореза в условиях невесомости на орбитальных космических станциях.

241

Основное практическое значение имеет электрофорез в гелях (гель-электрофорез). При использовании гелей практически исчезает опасность конвекции, резко уменьшается коэффициент диффузии и размывание зон незначительно. В результате на одном геле длиной около метра можно получить до сотни или даже более зон. Наиболее широко используется электрофорез в сшитых полиакриламидных и агарозных гелях. Агароза является компонентом агар-агара, содержащегося в красных морских водорослях. Она построена из чередующихся остатков D-галак-тозы и 3,6-ангидро-Ь-галактозы, связанных попеременно ?(1 —> 4)- и а(1 —» 3)-связями:

СН2ОН HQ '

он

Гель возникает в результате образования водородных связей между цепями ага-розы и в отличие от полиакриламида не содержит ковалентных межцепных сшивок.

При электрофоретическом разделении нуклеиновых кислот в геле удается разделять фрагменты длиной в сотни нуклеотидов, различающиеся на одно звено. При этом действуют два фактора — удлинение полинуклеотида приводит одновременно к возрастанию заряда и к увеличению сопротивления среды его перемещению. Второй фактор пересиливает, и в связи с этим быстрее перемещаются более короткие полинуклеотидные фрагменты. Примеры электрофореграмм приведены на рис. 77 и 78.

Зональное разделение можно также проводить с помощью седиментации биополимеров в центробежном поле в ультрацентрифугах*. Величиной, характеризующей подвижность частиц в центробежном поле, является константа седиментации S, представляющая собой отношение скорости перемещения седиментиру-ющей частицы к величине центробежного ускорения w2r, где ? — угловая скорость вращения ротора ультрацентрифуги, г — расстояние частицы до оси ротора. Константа седиментации может быть экспериментально определена в специальных аналитических центрифугах, позволяющих фиксировать положение зоны, содержащей исследуемый биополимер, в произвольный момент времени непосредственно во вращающемся роторе и тем самым измерять скорость перемещения частиц. Константа седиментации выражается уравнением

S= т[1-(*,//>)]//. (7·3) где т — масса частицы;^ — плотность растворителя; ? — так называемая плавучая плотность частицы, т.е. та плотность, которую она имеет, находясь в растворе (это величина, равная 1/иуд, где иуд — парциальный удельный объем); / — коэффициент вязкого трения.

Если разделяемую смесь нанести в виде зоны поверх растворителя в центри-

* См. Кнорре Д.Г., Крылова Л.Ф., Музыкантов B.C. Физическая химия — М.: Высшая школа, 1990. § 18.3. 242

фужной пробирке, то в ходе центрифугирования вещества, различающиеся по константам седиментации, будут формировать отдельные зоны. По окончании центрифугирования можно либо проколоть дно пробирки и по каплям разлить содержимое в ряд приемников так, чтобы образовавшиеся зоны попали в разные приемники, либо отсосать содержимое пробирки через опущенную до дна трубочку, опять-таки собирая серию фракций. Чтобы не происходило перемешивания содержимого пробирки при раскручивании ротора и при его остановке, используют специальные роторы (так называемые бакет-роторы от англ. bucket — ведро), в которых пробирки подвешены на шарнирах и разворачиваются по направлению поля от вертикального в начальный момент времени (направление поля силы тяжести) до практически горизонтального при полном наборе скорости и в обратном направлении при остановке ротора.

Чаще всего разделяемую смесь наносят на раствор сахарозы, который приготовлен таким образом, что уже в верхнем слое его плотность выше, чем плотность наносимого образца (иначе произошло бы практически мгновенное перемешивание), и постепенно возрастает в направлении к дну пробирки. Наличие градиента концентрации сахарозы существенно ослабляет диффузионное размывание зон, так как если по ходу перемещения зоны какого-либо биополимера часть его в результате диффузии опережает движение основной зоны, то она попадает в область с более высокой плотностью растворителя р0 и в соответствии с (7.3) их перемещение затормаживается, а в случае их диффузии в сторону отверстия пробирки по той же причине их движение ускоряется. В обоих случаях частицы, ушедшие из <своей> зоны в результате диффузии, отбрасываются обратно.

Поскольку при наличии аналитической ультрацентрифуги константы седиментации легко определяются путем фотографирования границы седиментации исследуемого биополимера при нескольких различных временах от начала седиментации, то константы седиментации часто используют как физико-химические характеристики биополимеров и их комплексов. Применительно к рибосомам это уже отмечалось в § 3.8.

Описанные выше методы по своей сути динамические, разделение происходит по мере перемещения веществ вдоль системы. Наряду с ними применение нашли равновесные зональные методы, в которых система приводится в равновесие с некоторым приложенным внешним полем — электрическим или центробежным — и зоны, соответствующие разным веществам, останавливаются в разных участках системы.

Наиболее широкое применение нашел метод изоэлектрической фокусировки. Он основан на создании под действием внешнего электрического поля стабильного градиента рН, причем значение рН возрастает от анода к катоду. В такой системе каждый белок перемещается в том или ином направлении в соответствии со знаком своего заряда до тех пор, пока не достигнет участка, в котором значение РН совпадает с его изоэлектрической точкой. На этом участке дальнейшее его перемещение под действием электрического поля прекращается, так как его заряд становится равным нулю. Приложенное поле, поддерживающее стабильный гРадиент рН, препятствует также диффузному размыванию зоны. Механизм аналогичен только что рассмотренному эффекту градиента плотности раствора сахарозы на стабилизацию зон при седиментации. Действительно, если в результате Диффузии белок уходит из участка, на котором рН = pi, в сторону катода, он попадает в область более высоких значений рН и заряжается отрицательно. Под

243

действием электрического поля он должен начать перемещаться к аноду, т.е вернуться на исходный участок. То же самое происходит и в случае диффузии в сторону анода. Если сочетать эту процедуру с использованием полиакриламидно-го геля, то зоны получаются очень узкими и внешне напоминают изображение хорошо сфокусированного пучка, с чем и связано название метода.

Для создания стабильного градиента рН используют специальные вещества, получившие название амфолинов. Это смесь коротких полимерных молекул, содержащих в различных соотношениях карбоксильные и аминогруппы. Иными словами, амфолины — это смесь молекул амфотерных электролитов с разными значениями изоэлектрических точек. В постоянном электрическом поле они перемещаются в растворе или в геле до достижения зоны, в которой их суммарный заряд равен нулю, после чего до тех пор, пока приложено электрическое поле, они будут оставаться на месте. На этом участке они играют роль буферного компонента, поддерживающего стабильное значение рН.

В центробежном поле можно создать стабильный градиент плотности растворителя. Как известно из теории седиментации, вследствие диффузионного размывания границы седиментации в конечном итоге в центрифужной ячейке устанавливается равновесное распределение концентрации каждого компонента, описываемое уравнением

с = с0 ехр {- mol [1 - (Ро/р)] (г20 - г2)/(2кГ)}, (7.4)

где с — концентрация в точке, находящейся на расстоянии г от оси ротора; cq — концентрация на дне ячейки, находящейся на расстоянии го от оси ротора.

Используя соответствующую соль, можно создать устойчивый в условиях центрифугирования градиент ее концентрации, а тем самым и градиент плотности растворителя. Если природа соли и распределение ее концентрации таковы, что плавучая плотность биополимера выше, чем плотность растворителя на мениске, но ниже, чем у дна пробирки, то по мере перемещения к дну пробирки биополимер достигнет участка, где множитель 1 - ро/р станет равным нулю и дальнейшая седиментация прекратится, т.е. возникнет устойчивая зона нахождения биополимера. Наиболее широкое применение для этой цели нашли растворы солей цезия, которые позволяют получить растворы с плотностью, достаточной для остановки перемещения нуклеиновых кислот. Эксперименты подобного рода весьма дороги, так как требуют длительной, обычно на протяжении нескольких суток, работы ультрацентрифуг. Однако они открывают некоторые уникальные возможности. Например, удается разделить биополимеры, различающиеся лишь изотопным составом. Молекулы ДНК из одного вида микроорганизма, выращенные на средах, содержащих в качестве источника азота соли аммония 14NH4 и 15NH4, не отличаются по объему, но имеют разные массы и, следовательно, различные плавучие плотности. Поэтому при равновесном центрифугировании и градиенте плотности хлорида цезия" они образуют отдельные зоны. Пример применения этого метода для доказательства полуконсервативного характера репликации ДНК приведен в § 5.1.

Все описанные зональные методы — одномерные, разделение в них происходит по одной координате. Наряду с этим, особенно для аналитических целей, применяю

страница 60
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.08.2017)