Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

лучше, непрерывный поток воды через этот сосуд приводят к полному переходу в него всех проходящих через целлофан компонентов, а биополимеры остаются внутри целлофанового мешка. На этом же принципе основана улърафилътрация, при которой через проницаемую для низкомолекулярных веществ мембрану, закрепленную на пористой механически прочной подложке, пропускают под давлением подлежащий очистке раствор.

Все описанные выше методы грубого фракционирования, широко используемые на начальных этапах выделения биополимеров из биомассы, чаще всего не приводят к желаемому конечному результату, т.е. к получению индивидуального вещества. Последнее, как правило, достигается при использовании группы методов, которые можно квалифицировать как зональные методы разделения. Общая идеология этих методов состоит в том, что создается некоторая система, в которой компоненты смеси перемещаются с различными скоростями. Если в такую систему ввести разделяемую смесь в виде некоторой зоны, то по мере ее перемещения компоненты смеси, движущиеся в разными скоростями, будут формировать отдельные зоны, которые в конце процедуры разделения можно механически разнести в различные приемники, т.е. получить целую серию фракций.

Следует отметить, что скорость перемещения каждого компонента в определенной системе разделения и при заданных внешних условиях является его физико-химической константой и может быть использована для идентификации вещества или регистрации его присутствия в некоторой системе. Поэтому зональные методы наряду с их огромным препаративным значением имеют и важное аналитическое применение.

Важнейшим зональным методом является хроматографияМСак известно, хроматография бывает газовой, газожидкостной и жидкостной. По очевидным причинам при разделении биополимеров и их анализе используется только жидкостная хроматография. В жидкостной хроматографии зона разделяемых веществ в помощью тока элюирующей жидкости перемещается относительно неподвижной фазы, которая обладает разным сродством к разделяемым компонентам. При перемещении зоны с помощью тока элюента каждый из разделяемых компонентов проводит некоторую часть времени на неподвижной фазе, причем тем большую, чем выше его сродство к этой фазе. Чем больше это время, тем медленнее перемещается зона, содержащая выделяемое или анализируемое вещество, относительно неподвижной фазы.

В зависимости от природы физико-химического явления, лежащего в основе распределения веществ между подвижной и неподвижной фазами, различают адсорбционную, ионообменную, распределительную и гель-хроматографию. Последнюю также называют эксклюзионной хроматографией. В адсорбционной хроматографии в качестве неподвижной фазы наиболее широко используют оксид алюминия. В ионообменной хроматографии используются те же типы иони-тов, что и в ионообменной сорбции.

*См. Кнорре Д.Г., Крылова Л.Ф., Музыкантов ЯС. Физическая-химия.— М.: Высшая школа, 1990. § 18.4.

237

Распределительная хроматография основана на распределении веществ между двумя несмешивающимися жидкими фазами. При разделении биополимеров используют водно-органические фазы. Неподвижная жидкая фаза формируется в результате ее закрепления на пористом нерастворимом носителе силами полимолекулярной адсорбции. Если носитель по своей природе гидрофилен (целлюлоза, силикагель, стекло), то неподвижной является более гидрофильная жидкая фаза. Если же полимер, например силикагель, модифицирован объемистыми гидрофобными радикалами, то неподвижной является более гидрофобная фаза. В этом случае разделение называют хроматографией с обращенной фазой.

В гель-хроматографии используют те же типы материалов, что и в гель-фильтрации, но подбирают гели с таким диапазоном размеров пор, чтобы часть из них была доступна для разделяемых компонентов. Вследствие неоднородности пор чем больше по размерам разделяемые молекулы, тем меньшее число пор доступно для этих молекул и соответственно тем меньшую долю времени они будут проводить в неподвижной фазе. Следовательно, зоны, отвечающие молекулам большего размера, будут перемещаться с более высокими скоростями.

Следует напомнить, что чем ближе к равновесному распределение компонентов между подвижной и неподвижной фазами, тем более эффективно разделение. Время, необходимое для достижения равновесного распределения, тем меньше, чем меньше размеры частиц. Однако с уменьшением размера частиц сорбента сопротивление заполненной колонки потоку элюента становится сильнее. Поэтому необходимо использовать высокое давление для того, чтобы достигнуть хорошего разделения за короткое время. В последние десятилетия развивались специальные методы, основанные на применении высокого давления, позволяющего проводить элюцию за несколько минут, используя маленькие размеры частиц неподвижной фазы. Этот метод называют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ, или HPLC, High Pressure Liquid Chromatography). Приборы для ВЭЖХ (HPLC-хроматографы) выпускаются многими фирмами и стали неотъемлемой аппаратурой в каждой биохимической лаборатории. Значительное число сорбентов разрабатывается в различных фирмах, и колонки, наполненные этими сорбентами, также поставляются соответствующими фирмами. Все HPLC-приборы высокоавтоматизированы, что позволяет проводить непрерывную регистрацию разных физических характеристик элюируемого материала.

В табл. 7.1 приведены сорбенты и носители, наиболее широко используемые в жидкостной хроматографии биополимеров.

Таблица 7.]. Сорбенты и носители, используемые в жидкостной хроматографии

биополимеров

Полимерная основа и | Природа Область применения

коммерческое название ! функциональных групп

Целлюлоза j

СМ-целлюлоза I Карбоксиметильная

-о-си2-соо-

?

7ЯА

Носитель для распредели" тельной хроматографии

Продолжение табл. 7.1.

Полимерная основа и коммерческое название Природа функциональных групп Область применения

Р-целлюлоза SE-целлюлоза ДЕАЕ-целлюлоза АЕ-целлюлоза ТЕАЕ-целлюлоза Фосфоцеллюлоза -О-Р0з" Сульфоэтильная -o-c2h4-so3 Диэтиламиноэтильная -0-с2Н4Лн(с2н5)2 Аминоэтильная -0 с2н4гШз Триэтиламиноэтильная -0-с2н4-г)(с2н5)3 Катионообменная хроматография > Анионообменная хроматография То же >

Другие полимерные полисахариды (от G-10 до G-200)* SP-сефадекс Декстраны, сшитые мостиками -о-сн2-сн(0Н)сн2-0-с помощью эпихлоргидрина Сульфопропильная -0-(CH2)3-S03 Разделение по молекулярным массам Сочетание ионообменной хроматографии с молекуляр-но-ситовым действием

QAE-сефадекс Триэтиламиноэтильная -о-с2н4-1Цс2Н5)з

Агароза Сефароза СМ-сефароза Поперечно сшитый полиса-J харид на основе нейтрального компонента агара Сшивка -сн2-сн(он)сн2-0-сн2-образуется в результате взаи модейсгвия с 2,3-дибромпро-панолом Карбокси метильная -о-сн2-соо- 1 Для фракционирования j очень крупных молекул, высокополимерных ДНК вплоть до вирусов Носитель для аффинной хроматографии Катионообменная хромато-1 графия

Продолжение табл. 7.1.

Полимерная основа и коммерческое название

ДЕАЕ-сефароза

Полистирол

Сополимер стирола

CgH5—СНСН2 и дивинил-бензола С6Н4 (-СН=СН2)2

Фирменные названия: дау-эксы, амберлиты и др.

Полиакриламиды

Сополимеризация акрила-мида H2C=CHCONH2 и ?, N' -метилен-6"ыс-акриламида

BiO-Gel (от Р-4 до />-300)*

Акрил (от Р-4 до Р-3000)

Биогель СМ-2

Enzacryl С02Н

Силикагели

Золи кремниевой кислоты

Si40 Кизельгель 4000

(от 40 до 4000 1)

Лихросфер Si Лихросорб (Lichrocorb) Лихропреп (Lichroprep) Полигосил (Polygosil) Нуклеосил (Nukleosil)

Перисорб (Perisorb)

Видак(Vydac) 240

Природа функциональных групп

Диэтиламиноэт ильная -0-С2Н4Йн(С2Н5)2

Сульфокатиониты -СбН4 -SO3H Анионтьг

H2C=CHCONHCH2NHOOCH= СН2

Карбоксиметильная —СН2 -соо--COONa

Силанольные группы ^Si-OH

Силоксановые группы ^>Si-0-Si^

Гидрофобизированные силикагели

5>Si-0-Si<^- R

СНз

где R - этил (С2), октил (С8), октадецил (Cig) или фенил

Область применения

Анионообменная хроматография

Носитель для распределительной хроматографии с неполярными и полярными растворителями

Катионообменная хроматография

Анионообменная хроматография

Для разделения по молекулярным массам и для обессо-ливания

Катионообменная хроматография (устойчив к действию растворов кислот и щелочей до 1М концентрации)

Носитель для адсорбционной хроматографии

Носитель для хроматографии с обращенными фазами

Продолжение табл. 7.1.

Полимерная основа и Природа Область применения

коммерческое название функциональных групп

Гидроксиапатиты Суспензия или порошок Носитель для распредели-

ЗСа3(Р04)2-Са(0Н)2 тельной и адсорбционной

хроматографии

*В порядке возрастания размера пор, т.е. область разделения молекулярных масс.

Вторым широко используемым в биохимии зональным методом разделения смесей является электрофорез. В этом случае зоны создаются в результате того, что разные компоненты смеси с различной скоростью перемещаются в электрическом поле. Скорость перемещения ? определяется основным уравнением

Zes = fv, (7.1)

где ? — число единиц заряда у частицы; с — заряд электрона; е — напряженность приложенного электрического поля; / — коэффициент вязкого трения частиц. Последняя величина представляет собой отношение скорости перемещения частицы в вязкой среде к приложенной силе. Согласно уравнению Стокса для сферической частицы радиуса г,

/о = 6х1»г, (7.2)

где ? — вязкость среды, в которой проводится электрофорез. Радиус г сферической частицы с известной молекулярной массой и плотностью легко вычисляется, т.е. величину /0, ожидаемую исходя из предположения о сферической форме, нетрудно рассчитать. Для частиц несферической формы / больше, чем /0, причем чем более вытянута частица, тем существеннее это отличие. В связи с этим значение / дает определенное представление о форме биополимера. Например, для глобулярных белков это отличие, как правило, невелико, а для двуспиральных нуклеиновых кислот весьма существенно. Метод применим как для разделения нуклеиновых кислот, являющихся полианионами и в

страница 59
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(28.04.2017)