Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

мотрения все методы, при которых одна из фаз, между которыми происходит распределение, является газовой. Биополимеры в ощутимых количествах в газовой фазе не существуют.

Для выделения искомого биополимера из раствора можно воспользоваться осаждением, для чего необходимо понизить растворимость этого биополимера.

Растворимость биополимеров в воде в значительной мере определяется их способностью к гидратации. У глобулярных водорастворимых белков высокий уровень гидратации обеспечивается предпочтительным расположением на их поверхности гидрофильных групп. У нуклеиновых кислот важным фактором, способствующим гидратации, является наличие в нейтральной и щелочной среде отрицательно заряженных остатков фосфорной кислоты. Добавление органических растворителей понижает степень гидратации и приводит к осаждению гидрофильных биополимеров. Так, для осаждения белков используется добавление к их водным растворам ацетона. Нуклеиновые кислоты осаждаются добавлением этанола.

Роль электрического заряда в обеспечении растворимости биополимеров не исчерпывается формированием гидратных оболочек. Электростатическое отталкивание между ионными атмосферами, образуемыми противоионами, препятствует сближению этих молекул до критического расстояния, на котором это отталкивание уравновешивается силами ван-дер-ваальсова притяжения и становится воз-

233

можным слипание частиц. Нейтрализация заряда полимера обычно приводит к выпадению его в осадок. Нуклеиновые кислоты осаждаются из раствора при •добавлении сильных кислот, например хлорной, и при добавлении солей многозарядных ионов, например лантанидов. С этим же связано действие ионной силы на растворимость белков — высокая концентрация соли приводит к сжатию ионной атмосферы, образуемой противоионами, что ослабляет электростатическое отталкивание и облегчает сближение молекул полимера до критического расстояния, на котором ван-дер-ваальсово притяжение пересиливает кулоновское отталкивание и полимер выпадает в осадок. При этом концентрация соли, необходимая для осаждения, различна для разных белков, т.е. при определенной ее концентрации из сложной смеси выпадает в осадок лишь определенная группа белков. Остальные остаются в растворе и могут быть высажены последующим повышением концентрации осадителя. Наиболее широко используется с этой целью осаждение сульфатом аммония. Популярность в этой роли именно сульфата аммония связана, во-первых, с его очень высокой растворимостью, а кроме того, с тем, что, согласно многочисленным экспериментальным данным, даже высокие концентрации этой соли не оказывают заметного повреждающего (денатурирующего) действия на белки.

Заряд белков обусловлен в первую очередь остатками аспартата и глутамата, имеющими при нейтральном и щелочных значениях рН отрицательный заряд, и остатками лизина и аргинина, имеющими при слабоосновных и тем более при нейтральном и кислых рН положительный заряд. По мере повышения рН заряд белков проходит от положительных к отрицательным значениям и в изоэлектрической точке (см. § 3.1) оказывается равным нулю. Вблизи этой области белок оказывается лишенным ионной атмосферы и его молекулы могут беспрепятственно сближаться до радиуса действия ван-дер-ваальсова притяжения. В ряде случаев это приводит к выпадению белка в осадок. Такой способ выделения белков из раствора называют изоэлектрическим осаждением.

Выпавший осадок биополимера можно отделить от раствора фильтрованием. Известно, что фильтрование является высокопроизводительной операцией, применяющейся даже в промышленных масштабах. В то же время часто из-за мелкого размера выпавших частиц фильтрование проходит очень медленно, что затягивает процедуру выделения и может служить источником нежелательной инактивации биополимера. Поэтому в тех случаях, когда это не противопоказано масштабами разделения, в биохимии предпочитают использовать центрифуги. Широко используются рефрижераторные центрифуги с охлаждением камеры, в которой вращается ротор. Частицы осажденного вещества под действием центробежного поля оседают на дне центрифужных стаканов и сжимаются в плотный осадок, с которого оставшийся раствор (надосадочная жидкость, или супернатант) легко сливается или отсасывается. Скоростные центрифуги (улътрацентрифуш), создающие центробежное ускорение порядка 105 ускорений силы тяжести, т.е. порядка 106 м*с"2, позволяют осаждать даже некоторые достаточно крупные индивидуаль-¦ные надмолекулярные агрегаты, такие, как рибосомы и вирусы.

На начальных стадиях выделения биополимеров из растворов, осадков, а в ряде случаев и из исходной биомассы нередко используют экстракцию. Например, для выделения из биологического материала суммарной фракции липидов применяют экстракцию серным эфиром. Для очистки нуклеиновых кислот от основной массы белков и других биополимеров широко используется фенольная 234

экстракция — обработка материала смесью вода — фенол. Нуклеиновые кислоты при этом переходят в водную фазу, т.е. в насыщенный раствор фенола в воде, а белки в основной массе денатурируют и располагаются на границе раздела водной и фенольной фаз — в интерфазе.

Многие задачи по разделению веществ решаются с помощью сорбции части компонентов смеси на тех или иных сорбентах. В биохимии для этой цели часто используют гель фосфата кальция, известный также под названием гидроксиапа-тит. Для освобождения от низкомолекулярных соединений, содержащих ароматические кольца, применяют адсорбцию на активированном угле. Такие соединения взаимодействуют по механизму стекинга с полиароматической системой графита, составляющего основу активированного угля.

Заряженные компоненты можно сорбировать на ионитах — сорбентах, имеющих на поверхности заряженные группы. В исходном состоянии эти заряды в основном скомпенсированы какими-либо подвижными противоионами. Практически при сорбции на ионитах происходит обмен этих противоионов на сорбируемые одноименно заряженные компоненты разделяемой смеси, в связи с чем такую сорбцию часто называют ионообменной. Если на поверхности сорбента находятся отрицательно заряженные группы, то он связывает катионы и его называют катион итом. Сорбент, несущий положительно заряженные группы, называют антиони-том.

В качестве ионитов чаще всего используют материалы на гидрофильной основе — целлюлозе, декстране, силикагеле или пористых стеклах. Эти материалы превращаются в производные, несущие положительно заряженные анионообмен-ные группы или отрицательно заряженные катионообменные группы. Так, на основе целлюлозы путем соответствующих химических обработок получают ди-этиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу) и фосфоцеллюлозу, функциональные группы которых связаны через гидроксигруппы с остатками глюкозы:

-flGLc (1—i.)— flGLcd— О — uGLcd—Ч )— — eGlcd—'U )— pGLc (1—< I—aGlcO—U )— CH2CH2-NH PO3

фрагнент ДЭАЭ-'целлюлоэы фрагнент фосфоцеллюлозы

Наконец, разделение может проводиться по размеру частиц с использованием ситового эффекта. Молекулярные сита представляют собой материалы с порами определенного размера или с порами, размер которых находится в некотором определенном не очень широком диапазоне. Вещества, молекулы которых по Размеру меньше, чем размеры пор молекулярного сита, при пропускании через колонку с таким ситом задерживаются на некоторое время в этих порах и движутся медленнее, чем большие молекулы, которые обтекают частички сита и выходят в свободном объеме раствора. В качестве молекулярных сит в биохимии Наиболее широкое применение нашли так называемые сефадексы, представляющие собой полисахарид декстран, обработанный эпихлоргидрином, в результате чего слабо разветвленные цепи декстрана оказываются соединены (сшиты) трех-Углеродными мостиками:

235

—aGlcd—6)—aGLcd — 6) — etGLcd— 6)—

1

HOHC^ 0

I

—«GLcfl—6) — «GLcd—·6)— «tGLcd— 6)—

фрагмент сшитого участка сефадекса

Используется также синтетический полимер — полиакриламид, линейные цепи которого сшиты метиленовыми мостиками:

—СН—СН—СН—СН—СН —

со со I \

NH2 HN\

;сн2

NH2 HN/

I /

со со

—CHj-C Н-СН—СН—CHj-

фрагмент сшитого участка лолиэкрилэиида

Сшивки в этом случае возникают в результате добавления метиленбисакрилами-да в реакционную смесь, в которой проходит цепная свободнорадикальная полимеризация акриламида. Размер пор образующихся молекулярных сит регулируется при их получении количеством добавляемого сшивающего реагента. Вода, находящаяся в порах гранул молекулярного сита, образует неподвижную фазу, и в эти поры могут диффундировать частицы, имеющие не слишком большой размер. Для больших молекул эти поры недоступны и они проходят через колонку, заполненную гранулами молекулярного сита (геля), не задерживаясь и поэтому существенно опережая низкомолекулярные компоненты. Такой процесс разделения называют гель-фильтрацией.

Во многих из перечисленных методов разделения применяются в значительных количествах различные вспомогательные низкомолекулярные вещества — органические растворители, соли и кислоты, создающие нужные значения ионной силы и рН. Перед окончательным выделением очищенного биополимера или перед тем как подвергать частично очищенный материал следующей стадии фракционирования, обычно требуется избавиться от этих вспомогательных соединений. Для этой цели широко используется процедура, называемая диализом. Она основана на применении мембран, проницаемых для воды и низкомолекулярных веществ и непроницаемых для биополимеров. Чаще всего с этой целью используют мембраны (пленки) из целлофана, который представляет собой нитрат целлюлозы с содержанием остатков нитрата порядка одного моля на моль остатков глюкозы. Такой материал обладает необходимой механической прочностью и в то же время достаточно гидрофилен, чтобы через него проходили молекулы воды и гидрофильных низкомолекулярных компонентов. В то же время для полимерных

236

тыл ?

А

молекул, в том числе для белков и нуклеиновых кислот, целлофан непроницаем. В лабораторном варианте подлежащий диализу раствор биополимера помещают в мешок из целлофана и погружают последний в сосуд с водой. Многократная смена воды или, еще

страница 58
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2017)