Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

жение фундаментальные химические науки — неорганическая, органическая, аналитическая и физическая химия, а также химия высокомолекулярных соединений. В то же время природа исследуемых объектов, особенности решаемых задач накладывают свою специфику на использование этих методов, на их относительную значимость. Наиболее выпукло эти особенности проявляются при исследовании нерегулярно построенных биологических полимеров — белков и нуклеиновых кислот, которые являются более высокой формой организации материи, чем низкомолекулярные соединения и регулярно построенные гомополимеры, также широко представленные в живой природе, в первую очередь различными полисахаридами.

Становление биохимии как основополагающей биологической дисциплины началось с исследования веществ, существующих в живой природе, и химических процессов, происходящих в живых организмах. Поэтому среди методов, используемых в биохимии, ключевое значение имеют выделение веществ из биологических источников и, как правило, их очистка с целью получения индивидуальных соединений.

Следует отметить три главные проблемы выделения в индивидуальном виде компонентов из живых организмов, в особенности наиболее сложных компонентов — белков и нуклеиновых кислот. В значительной мере это касается и получения искусственных белков и нуклеиновых кислот, которое стало возможным в последние десятилетия.

Во-первых, исходный материал — биомасса, из которой предстоит выделить интересующее исследователя вещество,— состоит из многих сотен или даже тысяч различных соединений. Разделение таких смесей по уровню сложности не имеет себе равных среди других химических дисциплин. Это дополнительно усугубля-230

ется тем, что многие компоненты этих смесей, выполняя различные биологические функции, построены довольно однотипно. Например, смесь иммуноглобулинов в сыворотке крови представлена набором огромного числа белков различной специфичности, но они мало отличаются между собой по аминокислотному составу. В связи с этим они мало различаются между собой и по таким физико-химическим характеристикам, как растворимость или способность поглощаться определенным типом сорбентов, и поэтому для их разделения не могут быть использованы классические методы — осаждение, экстракция, адсорбция на традиционных сорбентах. То же можно сказать и о разделении смесей информационных РНК, которые могут быть представлены в используемом биологическом материале сотнями различных по структуре, но близких по своему нуклеотидному составу молекул.

Во-вторых, работа с биохимическими объектами, которая касается не только методов выделения и очистки, но и многочисленных исследовательских работ с ними, особенно с белками и нуклеиновыми кислотами, заключается в необходимости манипулировать с очень маленькими количествами вещества — миллиграммами, микрограммами и даже значительно меньшими. При выделении это связано с незначительным содержанием многих компонентов в исходной биомассе, а также в ряде случаев с ограниченным количеством биомассы, например при исследовании редко встречающегося животного или растения или очень мелких живых объектов, которые иногда добываются поштучно и доступны в небольшом числе.

Как при выделении, так и в ходе различных исследовательских процедур необходимо осуществлять детекцию выделяемых или исследуемых веществ. При ничтожно малом количестве материала используемые для детекции методы должны быть высокочувствительными. Поэтому в биохимии редко используются такие классические приемы аналитической химии, как гравиметрический или объемный анализ. Основными методами детекции являются спектрофотометрические методы, основанные на измерении поглощения видимого или ультрафиолетового света, радиохимические методы, основанные на измерении радиоактивности, и люминесцентные методы, основанные на измерении флуоресценции, био- и хеми-люминесценции.

В-третьих, многие компоненты обладают очень низкой устойчивостью. Часто задача состоит в том, чтобы выделить тот или иной биополимер в нативном, т.е. сохраняющем биологическую активность, состоянии. Между тем многие белки и высокополимерные нуклеиновые кислоты при умеренных температурах и незначительных изменениях рН среды подвержены необратимому изменению конформации — денатурации, которая обычно сопровождается потерей биологической активности — инактивацией. Кроме того, в клетках часто находятся ферменты, способные разрушать те или иные вещества. В первую очередь это относится к белкам и нуклеиновым кислотам, так как клетки обычно содержат ферменты, способные катализировать гидролиз этих биополимеров, — протеазы и нуклеазы. В неповрежденных клетках эти ферменты преимущественно сосредоточены в специальных гранулах — лизосомах. Однако при разрушении клеток или тканей/ которое всегда предшествует началу работ по выделению интересующих исследователя веществ, лизосомы обычно разрушаются, ферменты выходят наружу, что приводит к быстрому разрушению биополимеров уже в исходной биомассе.

Наряду с применением классических химических методов развитие биохимии

231

1

открыло принципиально новые возможности для проведения экспериментальных исследований. При определении первичной структуры белков и нуклеиновых кислот (см. § 7.7 и 7.8) необходимо расщепление исходных молекул на фрагменты меньшего размера, причем для получения гомогенных фрагментов нужно провести расщепление по строго определенным точкам. Это в основном достигнуто в случае белков вследствие применения специальных протеаз, таких, как трипсин, химотрипсин, эластаза, а в случае нуклеиновых кислот — с помощью специальных эндонуклеаз-рестрикции. Химический синтез генов позволяет достигнуть полинуклеотидов длиной в несколько десятков или одной-двух сотен нуклеотид-ных остатков. Получение более длинных цепей оказалось возможным вследствие соединения синтетических фрагментов в помощью фермента ДНК-лигазы (см. § 5.4). Синтез больших молекул РНК стал возможным при использовании транскрипции синтетических генов с помощью РНК-полимераз, среди которых особенно эффективными для этой цели оказались РНК-полимеразы бактериофагов Т7 и SP6.

Но особенно революционизирующее влияние на экспериментальные возможности биохимии оказало применение ферментов матричного биосинтеза, в первую очередь ДНК-полимераз. Аналитические возможности в биохимии нуклеиновых кислот неизмеримо возросли с появлением амплификации, т.е. размножения молекул ДНК с определенной последовательностью нуклеотидов с помощью ДНК-полимеразы. Применение прямой и обратной транскрипции позволило перенести многие методы, разработанные применительно к ДНК, на рибонуклеиновые кислоты (см. § 7.6).

Способность живых организмов и самих молекул ДНК к размножению открыла широкую дорогу селекционным методам для решения биохимических задач. Возможность вырезания из ДНК определенных генов, получения их путем обратной транскрипции матричных РНК и разработка методов искусственного химико-ферментативного синтеза генов позволили манипулировать генами, в том числе вставлять их в плазмиды или вирусы, а затем вносить их в микроорганизмы для последующего размножения. Микробиологические методы позволили разработать методы селекции тех популяций микроорганизмов (клонов), которые выросли из отдельных клеток, несущих желаемые признаки, например способных продуцировать определенные белки, не свойственные этим организмам. Так родилась генная инженерия, которая не только открыла новые горизонты в биотехнологии, но и стала важнейшим инструментом биохимических исследований.

Наконец, селекция ДНК или РНК из искусственно созданной смеси огромного числа различных молекул нуклеиновых кислот с последующим размножением отобранных ДНК путем амплификации открыла путь к созданию нуклеиновых кислот с самыми разнообразными заданными свойствами. Все эти новые подходы также будут описаны в соответствующих параграфах этой главы.

При рассмотрении классических методов основной акцент делается на те из них, которые находят существенно меньшее применение при изучении объектов неживой природы и низкомолекулярных соединений. Методы, широко используемые фундаментальными химическими дисциплинами и поэтому подробно разбираемые в соответствующих химических курсах, упоминаются лишь вкратце с акцентом на, специфику их использования применительно к живым объектам-Основное же внимание в этой главе уделено специальным методам, порожденным самим развитием биохимии и тем модификациям физических методов исследова-232

яия структуры, которые сделали возможным применять самые могучие инструменты структурной химии, такие, как рентгеноструктурный анализ и двумерная ^ ЯМР-спектроскопия, к сложнейшим биохимическим объектам, каковыми являются белки и нуклеиновые кислоты.

7.1. ТРАДИЦИОННЫЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БИОПОЛИМЕРОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ФИЗИЧЕСКОЙ И АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ

Все методы разделения смесей основаны на том, что разделяемые компоненты в результате каких-либо манипуляций оказываются в разных участках системы и могут быть механически отделены друг от друга. Наиболее производительные процедуры разделения основаны на различном распределении веществ между двумя фазами. Любая такая процедура приводит к разделению исходной смеси на две части (фракции), в одну из которых преимущественно или полностью переходит выделяемый компонент. Ввиду исключительной сложности смесей, с которыми имеют дело биохимики, на первых этапах разделения в подавляющем большинстве случаев фракция, содержащая выделяемое вещество, содержит множество других компонентов, т.е. происходит лишь частичная очистка (обогащение смеси искомым компонентом).

Выделение индивидуальных биополимеров является поэтому многоступенчатым процессом. На каждой ступени разделения должна получаться фракция, более богатая выделяемым веществом, чем на предыдущей ступени, и содержащая меньшее число побочных компонентов. Такой процесс часто называют фракционированием.

На каждой стадии разделения, включая и начальную, биополимер находится либо в виде раствора, либо в виде осадка. Говоря о разделении биополимеров, можно сразу же исключить из расс

страница 57
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.10.2017)