Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

м, для формирования двунитевой ДНК копии геномной РНК вируса ВИЧ-1 необходимо проявление трех активностей: обратной транскрипции для синтеза однонитевой ДНК, ДНК-полимеразной активности для получения двунитевой ДНК и, наконец, активности РНКазы Н. Оказывается, все эти активности присущи самой обратной транскриптазе вируса ВИЧ-1. Однако самое удивительное состоит в том, что переключение активностей происходит строго упорядочение, это не просто три параллельно работающих активных центра на одном ферменте. Последовательность происходящих событий представлена на рис. 68. Рассмотрим ее более подробно.

Как всякая ДНК-полимераза, обратная транскриптаза может осуществлять лишь реакцию элонгации; для включения ее в работу нужен праймер. Роль праймера в зараженной клетке играют для ретровирусов определенные тРНК, в данном случае лизиновая тРНК. Ее 3 '-концевой фрагмент комплементарен определенному участку геномной РНК, который называют праймер-связывающим участком (РВ). Он находится вблизи 5'-конца геномной РНК, соседствуя с участком, обозначаемым как Us, за которым следует находящийся на 5 -конце на участок R, идентичный участку, находящемуся на 3 '-конце геномной РНК. Так что на первом этапе происходит обратная транскрипция всего-навсего небольшого кусочка РНК-овой последовательности и процесс на этом мог бы просто оборваться, остался бы прочный дуплексный участок на 5'-конце геномной РНК. Этого, одна-??? не происходит, так как в работу включается Н-РНКазная активность. Прочитанная информация в виде фрагмента R—U5 уничтожается, и возникает ДНК-Фрагмент, комплементарный уничтоженному фрагменту R—Us, который обозначают как R'~Uj. Затем на ферменте происходит новый пируэт — R' перескакива-

61 на имеющийся на противоположном конце геномной РНК комплементарный ему участок R, образуя праймер для продолжения работы обратной транскрипта-3Ы- Последняя получает теперь возможность провести обратную транскрипцию

??

1 о

«?.....г"|""|...................'............................iII?1"***

всей оставшейся части геномной РНК, в том числе, вытеснив тРНК, переписать в виде ДНК участок BP связывания праймера. Так как эта ДНК является комплементарной копией геномной плюс-РНК, то она должна рассматриваться как минус-ДНК. Получается полная ДНК-реплика геномной РНК вируса с тРНК на 5 '-конце. Информация с геномной ДНК уже считана. Но для получения второй нити ДНК (плюс-ДНК, с той же последовательностью, что и геномная РНК) все еще нужен праймер. Он создается специфичным разрывом оставшейся части РНК в участке, предшествующем фрагменту U3, который находился на ее 3 '-конце перед R. В результате этого формирование плюс-ДНК начинается с воссоздания участка Из-R-Us-"РВ. На этом использование РНК заканчивается, РНКазы ? завершает работу по ее деградации и фермент целиком переключается на работу в режиме ДНК-полимеразы. Начавшая синтезироваться плюс-цепь зацепляется освободившимся участком РВ за 3 '-конец минус-ДНК. Это дает возможность последней продолжить элонгацию до полного считывания 5 '-конца начавшей формироваться плюс-цепи. Одновременно плюс-цепь получает возможность элон-гироваться до достижения 5'-конца минус-цепи. Как видно из схемы, при этом ва обоих концах линейной двунитевой ДНК возникают идентичные структуры, известные как длинные концевые повторы (long terminal repeats, LTR), с помощью которых происходит встраивание вирусной ДНК в геном.

Из приведенной достаточно сложной схемы видно, что на протяжении функционирования происходят нетривиальные события. Так, на первой фазе идет образование гибридного дуплекса участка R—U5. Если бы в момент обратной транскрипции участка W~U5 в работу одновременно включилась активность РНКазы Н, мог бы деградировать еще не прочитанный участок геномной РНК и процесс был бы нарушен. Разрешение на включение РНКазы ? должно даваться только по завершении обратной транскрипции на 5'-конце геномной РНК. Нетривиальным событием является скачок, совершаемый геномной РНК после освобождения фрагмента ДНК от РНК. Важным и нетривиальным событием является последующий разрыв геномной РНК в определенной точке перед фрагментом U3, чем задается структура длинного концевого повтора. Опять-таки нетрудно заметить, что вопрос о переключении активностей в пределах одного работающего фермента также требует рассмотрения с позиций молекулярной Динамики.

Таким образом, несмотря на большие успехи молекулярной энзимологии в изучении структуры комплексов фермент—субстрат, перед этой областью биохимии стоят новые, еще более сложные задачи, без решения которых ни понимание молекулярного механизма работы ферментов, ни принципы конструирования искусственных ферментов не будут достаточно полными.

рис. 68. Работа обратной транскриптазы на примере фермента из вируса ВИЧ-1, вызывающего СПИД:

1 - синтез минус-цепи ДНК, содержащий в качестве праймера тРНК; 2 - гидролиз РНКазой Н-Участка плюс-цепи РНК, содержащего R и U5; 3 - первый скачок. Образование дуплекса 3 '-конца плюс-цепи РНК и R '-фрагмента вновь синтезированной минус-цепи ДНК и начало синтеза минус-Цепи ДНК; 4 - элонгация синтеза минус-цепи ДНК; 5 - образование ника в РНК в точке, предшествующей участку U5; 6 - синтез плюс-цепи ДНК и образование U3, R, U5, РВ области, комплементарной Ug, R', U5'; 7- расщепление тРНК-фрагмента минус-цепи РНКазой Н; 8 - завершение

синтеза плюс-цепи ДНК; 9 - завершение синтеза двухцепочечной ДНК

Задачи

6.1. В активном центре лактатдегидрогеназы обнаружены следующие аминокислотные остатки, участвующие в связывании пирувата: Arg-171, llis-195, Asp-168 и Arg-109. Изобразите гипотетическую модель взаимодействия пирувата с этими остатками и вытекающий из этой модели механизм переноса гидрид-иона.

6.2. Триозофосфатизомераза катализирует реакцию изомеризации между дигидрокси-ацетонфосфатом и D-глицеральдегидфосфатом:

сн2он \^ с=0 = ?-?-?? снгоро|" сн2ороГ

Известно, что фермент работает без участия кофакторов и без образования промежуточных продуктов. Какие аминокислотные остатки могут участвовать в формировании активного центра фермента? Предложите гипотетическую модель активного центра.

6.3. Обратная транскриптаза вируса птичьего миелобластоза катализирует синтез нуклеиновых кислот (ДНК, РНК), используя в качестве матрицы РНК. За скоростью реакции полимеризации следят по включению радиоактивного нуклеотида. Исходя из данных, представленных в таблице (число импульсов в минуту в пробах, отбираемых через определенное время), определите кинетические параметры Км и klnax для ундекануклеотида (pdT)iopdC, используемого в качестве затравки на поли (А) матрице. Удельная активность РРР— [3Н]Т составляет 9· 1013 тБк/моль, эффективность счета — 30%, объем проб— 10 мкл.

Время, мин Число импульсов в минуту при концентрации

( моль/л)(pdT) lopdC

1,05· 10'* 2,1· ??"8 4,2-10"8 6,3-10"* 8,4· ??"8

1 13 383 19 783 25 478 23 807 26 816

2 24 943 38 056 42 748 52 221 57 190

3 35 G62 59 179 65 048 79 085 86 223

,4 49 964 70 630 97 016 109 354 114 023

5 59 497 93 061 116 614 125 468 145 278

6.4. Панкреатическая рибонуклеаза катализирует гидролиз фосфодиэфирных связей РНК по двустадийному механизму с образованием промежуточного соединения — цикли-ческого-2',3'-фосфата [см. уравнение (VI.1)].

Для исследования ингибирования рибонуклеазы дезоксидинуклеотидом d(pTpA) в качестве субстрата использовали 2', 3'-цикло-СМР.

При^ гидролизе циклофосфата доЗ'-СМР наблюдается изменение поглощения при 292 нм ?4292, что позволяет следить за гидролизом спектрофотометрнческим методом. Из данных, представленных в таблице, определите А"щ для 2',3'-цикло-СМР, А", для d(pTpA) и тип ингибирования. 228

Концентра- Концентрация Начальная Концентра- Концентрация Начальная

ция сСМР, d(pTpA), скорость гид- ция сСМР, d(pTpA), скорость гид-

моль/л моль/л ролиза, моль/л моль/л ролиза,

ДЛодз/мин ДЛ29з/мИН

5-Ю-" 0 3,4-10-2 7-10-4 0 4,2- ??"2

1,1-10-4 2,9-10-2 1,1-10-4 3,9-10-2

3,5·10-4 2,7- ??"2 3,5-10-4 3,3- ??"2

6-Ю"4 0 3,8-Ю"2 8-Ю-4 0 4,4-10-2

1,1-10-4 3,5-10-2 1,1-10-4 4,0-10-2

3,5-10-4 3,0-10-2 3,5-10-4 3,6-10-2

1,0· 10'3 0 4,8-10-2

1,1-10-4 4,4-10-2

3,5-10-4 4,0-10-2

6.5. В ряде случаев кинетические исследования ферментативных реакций удобно проводить в условиях избытка фермента по отношению к субстрату, т.е. [li] ( > s. Выведите для этого случая уравнение Михаэлиса — Ментен для текущей и начальной скоростей.

6.6. Дву субстратная реакция протекает с участием двух сильно разл и чающихся по своей структуре субстратов. Как можно определить порядок присоединения субстратов к ферменту, используя поочередно не способные к превращению структурные аналоги одного и другого субстрата? Выведите соответствующие уравнения в предположении о квазиравновесии всех участвующих в процессе комплексов.

6.7. Используя значения ? А' для участвующих в катализе остатков гистидина, определите, при каком значении pll Vnall для панкреатической рибонуклеазы достигает максимального значения и в каком интервале значений рН Vnax уменьшается не больше чем на 10% от максимального значения.

ГЛАВА 7

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОПОЛИМЕРОВ

Биохимия является одновременно и биологической, и химической дисциплиной. Биологической она является в первую очередь по природе изучаемых ею объектов, которые представлены веществами животного, растительного и микробного происхождения. Биологической она является и по тем конечным целям, во имя которых проводятся биохимические исследования — познание свойств и выяснение механизмов функционирования веществ, из которых построена живая материя. В то же время, будучи наукой о веществах и о протекающих с их участием химических превращениях, биохимия по своей методологии является химической дисциплиной. Она использует разнообразные методы, которые предоставляют в ее распоря

страница 56
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.09.2017)