Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

олько находясь в прямом контакте с субстратами. Образование комплекса фермент — субстрат (один пли несколько) является первой стадией ферментативного катализа. На этом положении оенрвапо все кинетическое рассмотрение ферментативных реакций. В самом простом варианте, когда за образованием комплекса непосредственно следует превращение, причем оно рассматривается как необратимое и является лимитирующей стадией всего процесса, квазпетацпопнрпая кинетика описывается уравнением Михаэлиса — Ментен. Понятия о максимальной скорости и константе Михаэлиса являются фундаментальными в современной энзимологии. На этом же постулате основано рассмотрение более сложных ферментативных реакций и разработана методология составления схем таких реакций и вывода кинетических уравнений. На основе этого же постулата разработаны подходы к выводу более сложных уравнений, описывающих начальную фазу ферментативной реакции, до того, как установился квазистационарный .режим, описываемый уравнением Млхаэлиса—Менте" (предстационарпы й режим).

Второе важнейшее положение, вытекающее из всего опыта энзимологии, состоит в том, что ферменты используют только хорошо известные в химическом учении о катализе типы каталитических механизмов. В простейшем случае это может быть просто кислотно-основный катализ, осуществляемый с помошьЮ нескольких кислотных или основных групп белка-фермента. Классическим примером является катализ расщепления полирибонуклеотпдной цепи с помош.ы° панкреатической РНКазы (см. § 6.1). Большая группа ферментов, в первую оче-222

редь так называемых сериновых протеаз, в которую входят трипсин, химотрип-(.„н, эластаза и многие другие ферменты, работают по механизму нуклеофильного катализа. В знаменитой триаде аспартат—гистидин—серии протон ОН-группы серина в активном центре фермента оттянут. Это облегчает нуклеофильную атаку карбонильной группы на гидроксигруппу серина с разрывом пептидной связи, образуемой этой карбонильной группой в субстрате. Следует отметить, что при этом амидная группа разрываемой пептидной связи должна превратиться в аминогруппу, что может быть облегчено подачей протона от какой-либо кислотной группы фермента, т.е. нуклеофильный катализ может сопровождаться кислотным катализом. Ферменты могут осуществлять также электрофильный и окислительно-восстановительный катализ. В этом случае, однако, необходимо привлечение специальных кофакторов. В случае электрофильного катализа таковым может быть ион металла. Классическим примером является фермент карбоксипептида-яа, который катализирует гидролиз С-концевой пептидной связи. Центральную' роль играет атом Zn2*, который координирован двумя имидазольными кольцами гистидинов и карбоксильной группой глутамата, сохраняя при этом один положительный заряд. Окислительно-восстановительный катализ осуществляется ферментами, использующими в качестве кофактора сложные органические молекулы, способные переносить электроны, например флавиновые нуклеотиды.

Роль белка или белковой части фермента (апофермента) состоит помимо прямого участия в катализе в связывании в определенном участке кофактора и в связывании субстрата или субстратов с определенной ориентацией их относительно каталитически активных групп. При этом осуществляется отбор строго определенных субстратов из множества сходных молекул, в принципе способных к таким же реакциям. Например, специфичность карбоксипептидаз именно к С-концевым остаткам в значительной мере обусловлена тем, что в связывании и ориентации относительно атома цикла принимают участие положительно заряженные остатки аргинина, которые взаимодействуют с концевой карбоксильной группой гидролизуемого пептида.

К настоящему времени накоплен огромный материал по структуре комплексов фермент — субстрат. Роль отдельных групп в отборе субстрата или в каталитическом акте, гипотетически вытекающая из этих структур, сегодня во многих случаях подтверждается сайт-направленным мутагенезом, одним из важнейших методов выявления роли отдельных аминокислотных остатков в функционировании белка (см. § 7·11). Это позволяет заменить определенный аминокислотный остаток, предположительно участвующий в узнавании или в каталитическом акте, на лю-Другой путем создания соответствующей мутации в гене, программирующем исследуемый фермент или апофермент. Сохранение или, наоборот, исчезновение каталитических свойств является доводом в пользу или против роли данного остатка в каталитическом процессе. Однако сегодня установлены структуры ничтожно малой части ферментов и апоферментов и можно думать, что дальнейшее накопление материала по этому вопросу послужит основой для новых интересных обобщений.

В то же время, как уже вкратце отмечалось в § 6.1, рассмотрение механизма Узнавания исходит из статической картины взаимодействия фермент—субстрат.

"Жду тем накопилось немало вопросов, получение ответов на которые на моле-*Удярном Уровне требует динамического рассмотрения. Скорее всего именно в эту *сть постепенно перемещаются главные проблемы молекулярной энзимологии. Некоторые из таких вопросов уже вкратце упоминались. Это, во-первых, нап-

221

равленные конформационные переходы, сопровождающие образование комплекса фермент—субстрат, постулированные Кошландом и наблюдаемые экспериментально в отдельных случаях. Во-вторых, это вопросы аллостерической регуляции (см. § 6.3). Аллостерический ингибитор, по-видимому, вызывает направленный кон-формационный переход, приводящий к нарушению структуры активного центра фермента и тем самым к его частичной или полной инактивации. В-третьих, это процесс транслокации, т.е. направленного перемещения матрицы и синтезируемого белка или нуклеиновой кислоты на каждом звене элонгации матричного биосинтеза (см. § 5.3). К этому можно добавить некоторые другие проблемы.

Как уже говорилось, ферментативная реакция складывается из узнавания субстрата или субстратов с их размещением должным образом относительно активного центра фермента и самого акта катализа. Долгое время существовало представление, что узнавание, т.е. сродство субстрата к ферменту, может характеризоваться константой Михаэлиса, которая приближенно равна константе диссоциации комплекса фермент—субстрат, во всяком случае если величина ккат имеет тот же порядок или меньше, чем величина к.\ [см. уравнение (6.6)]. Это представление, качественно не подвергающееся сомнению, оказалось недостаточным, когда началось систематическое количественное рассмотрение вопроса о специфичности ферментов.

Эта проблема особенно остро встает в ситуациях, когда в живом организме присутствует несколько схожих по структуре субстратов. Впервые эта проблема возникла при рассмотрении вопроса о специфичности реакций, катализируемых аминоацил-тРНК-сннтетазамп (см. § 4.6). 13се транспортные РНК имеют сходную пространственную структуру, и в ряде случаев амппоацил-тРИК-синтетаза может катализировать, хотя и с очень небольшой скоростью, ацнлпрованпе соответствующей ей аминокислотой пе соответствующую ей тРНК, т.е. происходит ошибочное амниоацилироваиие тРНК. Казалось бы, дискриминация разных тРНК должна происходить на стадии узнавания, т.е. на стадии образования комплекса фермент^гРНК. Однако оказалось, что при специфичном и неспецнфичпом ами-ноацилировании для разных тРНК отличаются пе константы Михаэлиса, характеризующие стадию узнавания, а главным образом максимальные скорости процесса, т.е. кинетические константы процесса. В качестве еще одного примера можно привести фермент урацил-ДНК-гликознлазу, (см. § 5.1). Этот фермент катализирует выщепленне остатка урацила из ДИК. Следовательно, фермент должен четко дискриминировать остатки дТМФ и дУМФ в составе ДНК. Казалось бы, фермент должен узнавать те ДНК, в которых присутствует урацил Однако исследования, проведенные с ферментом из плаценты человека, показали, что сродство дуплекса, состоящего из p(u\\)15 и p(dT)15, измеряется константой диссоциации 6,5· 10"5 М, а в том случае, если во втором партнере вставлен один остаток pdUp(dT)7pdUp(dT)7, сродство изменяется всего на порядок, составляя 7·10"6 ?. Узнавание поврежденного учагтка оказывается недостаточным ДлЯ высокоизбирательного выщепления урацила.

Эти и ряд други» примеров заставляют предположить, что за актом узнава-ния, но перед каталитическим актом происходит некоторая более топкая нзапм ная подстройка субстрата с активным центром. Иными слонами, ферментативный процесс в таких случаях состоит из трех этапов: узнавания с образованием к°м плекса фермент—субстрат, топкой подстройки субстрата к набору каталитически rnvnn н гямпгп акта катализа. Неполно заметить, что такая подстройка являет

событием динамическим и выявление механизма этого процесса требует использования методов молекулярной динамики, о которых будет сказано в § 7.15.

Второе явление, происходящее на уровне единичного фермента, состоит в изменении по ходу функционирования фермента на определенных этапах типа его активности. Это, естественно, присуще тем ферментам, которые потенциально обладают несколькими разнотипными активностями. Очень интересным и важным в практическом отношении является обратная транскриптаза, огромный интерес к которой связан с тем, что она входит в состав вируса ВИЧ-1, вызывающего СПИД. Рассмотрим схематично механизм работы этого фермента.

Вирус ВИЧ в составе зрелой внеклеточной частицы содержит геномную молекулу РЙК. Однако развитие вирусной инфекции связано с этой РНК лишь в самой начальной фазе. По информации, содержащейся в этой РНК, воспроизводится молекула ДНК, сначала однонитевая. Затем на ней, как на матрице, воспроизводится комплементарная цепь и образующаяся двунитевая ДНК встраивается в геном инфицированной клетки. Именно эта ДНК далее управляет синтезом копий мРНК, необходимых для программирования синтеза вирусных белков, и самой РНК вириона, которая должна входить в состав новых вирусных частиц. Исходная же РНК при синтезе ДНК постепенно уничтожается с помощью активности, известной под названием РНКазы Н. Этот фермент катализирует гидролитическое расщепление РНК в составе гибридного дуплекса РНК-ДНК. Таким образо

страница 55
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.07.2017)