Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

ения ферментативной реакции называют неконкурентным итибирооанием. Кинетическое уравнение для этого случля получат из общего выражения (6.17) в предположении, что ? — 1, f — 0 и имеет вид

40 60 Vi, (мель/яг1

Рис. 66. Зависимость скорости гидролиза кя рбобе н:ы ?.????? гли иилфенилллннинн иод действием карбоксипептидазы от концентрат 111 субстрата:

/ - бе:< ингибитора: - в присугствии 0,0002 моль/л фенп.чукгуснои кислоты; .i - в присутствии 6.002 моль/л фенилпропионовой кислоты к координатах \?-\/? (по данным Кауфмана, и Нейратн)

г) =

1 +-s

^'|(ат[Е] ?

(6.22)

В координатах l/v—\/s зависимость скорости от концентрации субстрата при разных концентрациях ингибитора L имеет вид прямых линий, пересекающихся на оси абсцисс, поскольку

*кат[Е]( +

_\

к»л ?[Ь]?

(6.23)

В координатах v—v/s эти же зависимости представляют собой серию параллельных прямых линий:

(6.24)

Рассмотренные типы ингибиторов—конкурентные и аллостерические — действуют обратимо. Удаление их из системы полностью восстанавливает каталитическую активность фермента. Наряду с этим найдены в живой природе и получены путем химического синтеза многочисленные соединения, которые при контакте с ферментом приводят к необратимой инактивации. Как правило, это происходит в результате химической реакции такого ингибитора с каким-либо существенным для проявления каталитической активности участком фермента. Этот тип ингибирования рассматривается в § 7.17.

6.4. РИБОЗИМЫ

В начале 80-х годов произошло одно из наиболее неожиданных событий в развитии биохимии — было найдено, что в природе существуют катализаторы, лишенные белка и состоящие только из РНК. Это открытие первоначально было связано с изучением сплайсинга эукариотических ? ЦК. Многие гены эукариот имеют мозаичную структуру (см. § 5.5) с чередующимися последовательностями экзонов, которые должны войти в конечную структуру программируемой РНК, и интронов, которые должны быть удалены в процессе созревания РНК. По аналогии с другими видами процессинга РНК первоначально считалось, что существуют специальные ферменты, катализирующие сплайсинг. Однако в ряде случаев интенсивные поиски соответствующих белков успехом не увенчались. Оказалось, что в этих случаях способность вырезать нитроны и соединять после этого концы двух соседних экзонов присуща самой РНК. Впервые этот процесс был изучен на примере предшественника рРНК малой рибосомной субъединицы у одноклеточного эукариота Teirahymcna thermophila. Предшественник состоит из 6400 нуклеотидов, из которых 414 представляют собой нитрон. Исследования показали, что вырезание интрона происходит без участия какого-либо катализатора, т.е. представляет собой самосплайсинг. Формально этот процесс не является каталитическим, поскольку происходит в каждом предшественнике всего один раз. По происходит он с достаточно большой скоростью и очень селективно, строго по определенным точкам, разделяющим нитрон от двух смысловых участков предшественника. Иными словами, процесс несет на себе все основные черты ферментативного процесса. Таким образом родилось представление, что РНК-предшественник является ферментом, образованным молекулой РНК. Далее было установлено большое число аналогичных фактов и был введен термин рибозим, т.е. фермент (энзим), построенный из молекулы РНК.

Процесс, катализируемый рибозимом этого типа, можно представить в виде следующей брутто-схемы:

...,???-???,?????? ... pYn,|>Xj+ipXj«2... + С -» - - - рХ i-i рХ ,? X /+i X1+2 ¦·· +

+ CpYipV2 ... pY,„, (VI.3)

где ? _ нуклеозидные остатки, входящие в состав экзопа; ? — остатки в составе Интрона (номера обозначают положение соответствующего нуклеозцда в цепи); ш-Число нуклеотидных остатков в нитроне.

Согласно этой схеме, в процессе в качестве кофактора участвует гуапознн. Па первой стадии сплайсинга он присоединяется фосфоэфирпой связью к 5 '-фосфа-

ту первого нуклеотидного остатка нитрона. Одновременно происходит разрыв фосфодиэфирной связи между этим фосфатом и 3 '-кондом левого экзона-.

...pXi-ipXipYipY2 ... pYmpX1+1pX1+2 ... + G-+ ...??,-???, +

+ GpYipY2 ... pYmpX1+1pXi*2 · (VI.4)

Однако левый экзон, даже не будучи связан ковалентно с остальной частью предшественника, остается вблизи этой части и участвует во второй стадии также представляющей собой реакцию переэтерификации. При этом образуется связь между 3'-концом левого экзона и 5'-концом правого. В итоге интрон выщепляется в виде производного, содержащего дополнительный остаток гуано-зина на 5 '-конце, согласно уравнению

...pXi-ipXi + pXi*ipXi*2--- .. .рХ,--1 рХ ,?? ,*i рХ t*2 - - - »

GpYlPY2...pYm + GPYlPY2...pYm. (VI.5)

Второй тип вырезания интронов был обнаружен при изучении сплайсинга митохондриальных пре-мРНК. В этом случае сплайсинг начинается с внутримолекулярной атаки 2'-ОН-группы одного из внутренних остатков аденозина на 5'-концевой фосфат интрона. Возникает структура, в которой этот внутренний аденозин связан тремя фосфодиэфирными связями с участием всех его ОН-групп с соседями слева и справа и с концевым фосфатом интрона. После этого происходит соединение экзонов и выщепление интрона в виде структуры типа <лассо> (lariat) (98):

5' -»2'

...??,-???,?????2...??...???.??,+????+2··· -»...рХ,-1рХг + ?????2. · ¦?k...plimp\itlp\it2... -+

5' -»2'

?-1

-> ...?????,??,,???^... + pYipY2...pA...pYm (VI.6)

Эту структуру можно представить в виде

in*r

О II

-Р-0-

I

о-

98

0 ?-?

о=р—о -

1 .

??* 1

^Ade

II

?—Y,-

I

??™

220

Второй источник каталитически активных РНК — вироиды и вирусоиды. И те, и другие являются инфекционными молекулами РНК. Вироиды состоят примерно из 300 нуклеотидов и поражают некоторые растения. Их РНК не кодирует какие-либо белки, и механизм их патогенного действия еще не установлен. Одно из выдвигаемых объяснений состоит в том, что они образуют дуплексные структуры с определенными функционально значимыми РНК, парализуя их действие. Вирусоиды также представляют собой близкие по размеру к вироидам молекулы РНК, но в отличие от вироидов они могут размножаться лишь при одновременном заражении клетки вирусом-помощником. Для некоторых из них было установлено, что во время репликации внутри клетки они образуют цепи, состоящие из нескольких молекул РНК, и, следовательно, должны быть расщеплены по определенным точкам. Вероятно, это связано с тем, что их репликация происходит по механизму катящегося кольца, описанному для некоторых фагов, содержащих однонитевую ДНК. В инфекционные частицы они превращаются после саморасщепления по точкам, соединяющим две последовательности. В этом случае опять-таки речь идет об очень специфичном процессе, поскольку расщепление происходит в строго определенной точке полирибонуклеотидной цепи. Сравнительное изучение структур ряда вироидов и вирусоидов привело к заключению, что все они в области саморасщепления обладают определенной вторичной структурой, которая получила название структуры типа головки молотка (hammer-bead). Пример такой структуры представлен на рис. 67 для вирусоида, сопутствующего вирусу преходящей полосатости люцерны.Такая структура может быть синтезирована искусственно либо методами рибоолигонуклеотидного синтеза, либо путем транскрипции соответствующего синтезированного фрагмента двунитевой ДНК с помощью РНК-полимеразы. Это позволяет вносить во фрагмент природной структуры многочисленные изменения. В частности, исследования-показали, что эта структура может быть разделена на каталитическую часть и субстрат. Если эти две части получить в виде отдельных рибоолигонуклеотидов, 70 при их объединении происходит такой же гидролитический процесс, как и в полной структуре. Однако при этом один рибозим может последовательно расщепить большое число молекул субстрата. В этом случае расщепление происходит По схеме, характерной для панкреатической РНКазы с образованием 2',3'-цик-лофосфата и 5 '-ОН -группы. Кинетика процесса описывается классическим уравнением Михаэлиса с константой Михаэлиса А"м = 1,3 ?? и каталитической кон-стантой 0,5 мин"1. Последняя величина довольно мала по сравнению с характер-

Рис. 67. Структура типа головки молотка (hammerhead) для вирусоида, сопутствующего вирусу преходящей полосатости люцерны (vLTSV-mrusoid of the lucerne transient streak verus). Сплошной линией выделена субстративная часть, прерывистой - рибозим. Место расщепления указано стрелкой

221

ными для ферментов белковой природы, но па несколько порядков выше, чем в случае чисто химического гидролиза при тех же условиях.

Открытие рибозимов стимулировало исследования с целью выяснения возможности катализировать реакции другого типа с помощью РНК-катализаторов. Так как структурные мотивы, обладающие каталитическими свойствами, оказались довольно разнообразными, был применен получивший чрезвычайно широкое распространение в последние годы метод селекции in vitro (см. § 7.Г2).

Следует отметить, что открытие рибозимов вызвало серьезный интерес у ученых, занятых вопросами происхождения жизни. До открытия рибозимов, когда преобладала точка зрения, что катализаторами могут быть только белки, все время возникал вопрос: кто же появился раньше — нуклеиновые кислоты, которые необходимы для передачи из поколения в поколение информации, или белки, которые должны катализировать различные превращения, в том числе и реакции синтеза новых молекул нуклеиновых кислот, необходимых для сохранения и реализации информации? С открытием рибозимов появилась возможность спекулировать, что жизнь началась с нуклеиновых кислот, которые наряду с информационной функцией могли служить и катализаторами некоторого набора биохимических процессов. Белки могли появиться па более поздних этапах эволюции.

6.5. ДИНАМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ЭНЗИМОЛОГИИ

Из предыдущих параграфов этой главы можно видеть, что учение о молекулярных основах действия ферментов — молекулярная энзимологии — в XX в. прошло большой путь. Первым выдающимся достижением, сегодня представляющимся банальным, является осознание того факта, что ферменты осуществляют свое каталитическое действие т

страница 54
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2017)