Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

нергия активации, найденная из зависимости А;кат от температуры, составляет 31,5 кДж/моль, причем в основном это обусловлено температурной зависимостью константы ионизации протонироваппо-го имидазола в активном центре фермента. Для зависимости Щ?т1 от температуры, т.е. для барьера, преодолеваемого комплексом каталитически активной формы фермента с субстратом, барьер составляет всего лишь 4,2 кДж/моль. В то же время для реакции гидролиза того же циклофосфата, катализируемой имидазо-лом, и для прямого гидролиза водой эти величины составляют соответственно 46 и 71 кДж/моль при близких во всех трех случаях значениях энтропии активации (соответственно —204, —210 и —168 Дж-моль''-?"1). В ряде случаев характер зависимости может усложняться в результате смещения равновесия между р*3" личными конформациями фермента, различающимися по своим каталитическим характеристикам, при изменении температуры.

214

При изучении влияния как рН, так и температуры на скорость ферментативного превращения, необходимо следить, чтобы изменение рН или повышение температуры не выходило за допустимые пределы, индивидуальные для каждого фермента, так как это может привести к необратимой потере им каталитической активности (инактивации фермента). В этом случае в ходе ферментативного превращения может происходить падение скорости реакции, вызванное уменьшением полной концентрации сохранивших активность молекул, т.е. величины [E]f. Если кинетические измерения проводятся с целью получения кинетических параметров, следует ограничиваться измерениями начальной скорости превращения, т.е. проводить эксперименты в течение непродолжительного времени, за которое вкладом инактивации фермента можно пренебречь. Если же речь идет об использовании фермента как катализатора для получения некоторого продукта превращения или для удаления какого-либо нежелательного компонента из реакционной смеси, то следует подбирать оптимальную температуру, при которой положительный эффект, связанный с увеличением скорости реакции в результате повышения температуры, еще перевешивает эффект замедления от постепенно нарастающей во времени потери фермента в результате инактивации.

6.3. ИНГИБИРОВАПИЕ И АКТИВАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

Скорость ферментативных реакций помимо перечисленных в предыдущем параграфе факторов в большинстве случаев подвержена влиянию некоторых соединений, специфичных для каждого фермента. Одни из этих соединений ускоряют каталитический процесс — активаторы, другие замедляют его — ингибиторы ферментов. По принципу действия эти соединения можно разделить на три основные группы.

Первая группа — близкие аналоги субстратов, содержащие весь набор или, по крайней мере, большую часть групп, узнаваемых активным центром фермента, и поэтому образующие комплекс фермент — аналог, сходный с комплексом фермент — субстрат. Однако в силу специфики своей структуры они не подвергаются ферментативному превращению. Занимая активный центр, эти аналоги препятствуют связыванию субстрата и тем самым ферментативной реакции. Они фактически конкурируют с субстратом за взаимодействие с активным центром и поэтому их называют конкурентными ингибиторами (см. также § 3.10). Например, соединение (95) имеет весь набор групп, узнаваемых панкреатической рибонуклеазой (см. рис. 59, 60), но CIlj-группа, стоящая вместо атома 5 -0 субстрата, не способна принять протон от протонировапного His-119 и расщепления связи Р—С не происходит. Фенилпропионовая кислота содержит карбоксильную группу и гидрофобный фенильный радикал, в связи с чем связывается с активным центром Карбоксипептидазы А (см. рис. 62), но не имеет амидпой группировки и никакому превращению ферментом поэтому не подвергается. Оба указанных соединения являются типичными конкурентными ингибиторами соответственно панкреатической рибонуклеазы и карбоксипептидазы А.

Особую группу образуют кофакторы ферментов. В их отсутствие чшофермент *ообще не обладает каталитической активностью. Добавление их приводит к появлению каталитических свойств, причем с увеличением концентрации кофак-^Pa по мере насыщения им апофермента наблюдается ускорение каталитическо-Го превращения до некоторого предела, соответствующего полному насыщению.

215

Наконец, третья группа — вещества, которые взаимодействуют с дополнительными центрами фермента, не совпадающими с активным центром причем это взаимодействие, изменяя конформацию в районе активного центра влияет на кинетические параметры процесса. Эти дополнительные центры называют регуляторными, а сами соединения — аллостерическими эффекторами. У различных ферментов наблюдается и аллостерическая активация, и аллостерическое иншбирование. Эффекторы этого класса имеют важное биологическое значение, так как с их помощью осуществляется один из главных механизмов регуляции каталитической активности. Целевые, с точки зрения живого организма, продукты обычно образуются в результате цепочки биохимических превращений. Если этот продукт оказывается в недостатке, необходимо усиление работы системы ферментов, приводящих к его образованию. В случае накопления достаточного количества этого продукта целесообразно выключение всей системы приводящих к нему процессов. Поэтому в такие цепи, как правило, включены один или несколько процессов, регулируемых ферментами, подверженными аллостерической регуляции.

В качестве примера можно привести фермент фосфофруктокииазу, катализирующий перенос остатка фосфорной кислоты от АТФ иа атом 01 фруктозо-6-фосфата:

СН2ОН-СО-СНОН-СНОН-СНОН-СН2ОРОз'+ PPP-Ado --

-- 2"ОэРОСН2-CO-CHOH-CHOH-CHOH-CH2OPOJ" + PP-Ado

Данное превращение является одним из этапов многостадийного процесса, в результате которого происходит сопряженное окисление глюкозы и фосфорилирование АДФ с накоплением АТФ (§ 8.2; 8.4; 8.5). Весь процесс, приводящий к образованию на одну полностью окисленную молекулу глюкозы 38 новых миро-фосфатных связей (в рассматриваемом процессе одна из таких связей разрушается, но это с лихвой компенсируется последующими актами фосфорилнровапия АДФ), имеет своей главной целью пополнение энергетических запасов биологической системы в быстро утилизируемой форме, т.е. в виде пирофосфатпых связей АТФ. Поэтому при накоплении в системе достаточного количества АТФ процесс целесообразно выключить или, по крайней мере, притормозить. Это и имеет место в случае фосфофруктокипазы. Наряду с центром связывания АТФ как субстрата в активном центре фермента имеется дополнительный центр, связывание с которым молекулы АТФ приводит к аллостери чес кому торможению реакции образования фруктозо-1,6-дпфосфата. Вместе с тем расходование АТФ на процессы фосфорплированпя и энергетические потребности живой системы сопровождается накоплением АДФ и АМФ, поэтому повышение концентрации последних свидетельствует о дефиците АТФ. В соответствии с этим мопо- и ди-фосфат адепозина являются аллостерическими активаторами фосфофруктокипазы.

В простейшем случае односубстратпой реакции, катализируемой ферментом, состоящим из одной субъедппнцы, в киазправповоспом приближении кинетическое уравнение для скорости реакции в присутствии эффектора нетрудно получить из выражения (3.18). Переходя к обозначениям, принятым в эпзимоло-

216

гии: ? — фермент, S — субстрат (первый лиганд), L — эффектор (второй лиганд); К — константа диссоциации комплекса ES, — константа диссоциации комплекса EL, получаем

V = *кат[Е]*

— + 0 Sl

? + 1?+?

+ 0

si

(6.17)

где s, I — концентрации субстрата S и второго лиганда L.

Анализ этого выражения показывает, что если одновременно выполняются неравенства 0у < 1 и 7 < 1, то при любых концентрациях субстрата L функционирует как ингибитор. Если же неравенства имеют обратный знак, т.е. 0? > 1, ? > 1, то L функционирует как активатор.

В случае конкурентного ипгибпроваппя выражение для скорости ферментативной реакции можно получить, преобразуя аналогичным образом выражение (3.19);

IX

? = ?.·?3?[?]?

1 +

S

1 +

/

(6.18)

Такое же выражение получается в квазпстациопарпом приближении, с той лишь разницей, что вместо константы диссоциации К'^ в нем стоит константа

Михаэлиса А'и Согласно этому выражению увеличение концентрации субстрата приводит в конечном итоге к тому же значению максимальной скорости, что и в отсутствие ингибитора, однако для этого требуется более высокая концентрация субстрата. В частности, скорость, равная половине от максимальной, достигается при концентрации субстрата, равной А"м( 1 + ??\)· Линейные анаморфозы (6.10) и

(6.11) принимают вид /

+

1 +

? = Киах _ Xl

1 +

?'.

(6.19)

(6.20)

Поэтому данные экспериментов по зависимости г> — s при нескольких различных концентрациях ингибитора в координатах ]/v — 1/s должны изображаться прямыми линиями, пересекающимися на осп ординат. То же должно иметь место и в координатах ? — v/s. На рис. 66 представлена зависимость ? — s для катализируемого карбоксипептидазон А гидролиза карбобепзплоксиглпцилфепплаланина без ингибитора и в присутствии двух конкурентных ингибиторов — фепплуксуспой и фенилпропиоповой кислот в. координатах 1/и— 1/s. Нес три прямые пересекаются в одной точке на осп ординат.

Выражение для активации фермента кофактором можно получить из (6.17), полагая, что реакция происходит только в комплексе ESL, т.е. отбрасывая в чис-

217

лителе первый член, соответствующий превращению в отсутствие лиганда L Если при этом кофактор не оказывает влияния на сродство субстрата к ферменту, т.е. ? — 1, то кинетическое уравнение имеет вид

(1 + s/As)(l + l/Kh) -= *„ат[Е]Для аллостерического ингибирования и аллостерической активации фермента, состоящего из одной субъединицы или двух неэквивалентных субъединиц с разнесенными по ним центрами связывания субстрата и эффектора, следует пользоваться общим выражением (6.17). Среди получаемых зависимостей принято выделять особо предельный случай, при котором эффектор (ингибитор) по влияет на сродство субстрата к ферменту, по полностью выключает активный центр. 13 этом случае между субстратом и ингибитором нет конкуренции и этот тип тормож

страница 53
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.10.2017)