Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

ином, от концентрации аденозинтрифосфата в координатах ?- v/s (по данным Лейдлера)

210

? — v/s приведена аналогичная зависимость для гидролиза АТФ, катализируемого мышечным белком миозином, котррый принимает непосредственное участие в превращении избыточной энергии пирофосфатной связи АТФ в механическую энергию мышечного сокращения.

Схема (6.3) является простейшей схемой ферментативного превращения. Согласно ей фермент пребывает в двух состояниях — в свободном виде, когда его функцией является отбор молекулы субстрата, ? ? виде комплекса с субстратом,, когда его функцией является собственно ферментативное превращение. По мере повышения концентрации субстрата s среднее время, необходимое для эффективной встречи с субстратом, уменьшается, тогда как время внутримолекулярного превращения комплекса в фермент и продукт остается неизменным. Достижение максимальной скорости означает достижение столь высоких значений s, что время на встречу свободного фермента с субстратом становится малым по сравнению с временем каталитического превращения, т.е. времени на поиск очередной молекулы субстрата фермент практически не затрачивает.

Константа Михаэлиса в определенной мере характеризует сродство фермента к субстрату. Так как эта величина является аналогом константы диссоциации комплекса ES, то чем ниже Ам, тем выше сродство. В то же время Ам, как следует из (6.6), превышает константу диссоциации комплекса ES. Как видно из уравнения (6.9), А"м численно равна значению s, при котором достигается значение скорости, равное половине от VniaK.

Данные по зависимости ? от s в квазистацпонарном режиме позволяют определить значения двух параметров: А'м и 1'шх, что, в свою очередь, даст возможность вычислить константу скорости каталитического превращения /;кат. Значения fcj и fc-i по отдельности из этих величин по определяются и могут быть найдены лишь при постановке специальных экспериментов, например наблюдения за кинетикой превращения субстрата в период установления квазистнцпонарного режима (предстационарная кинетика). Этот период, как правило, измеряется малыми долями секунды, поэтому применяют экспериментальные методы кинетики быстрых реакций — метод остановленного потока и метод температурного Скачка. Изложение теории и экспериментальной техники этих методов выходит за рамки данного курса.

Схема (6.3) является простейшей, так как предполагает участие в реакции одного субстрата и необратимость реакции. Уже для одпоеубетрнтпой обратимой реакции схема усложняется и число кинетических параметров, необходимых для ее описания, возрастает. Усложняется и вид кинетического уравнения. Еще в большей мере это относится к двух- и трехсубстратпым реакциям. Систематическое изложение этого вопроса можно найти в специальных руководствах по кинетике ферментативных реакций. В качестве примера более сложного случая ниже рассматривается необратимая реакция, протекающая с участием двух субстратов Si и S2, причем предполагается, что имеет место определенный порядок их присоединения, а именно: сначала присоединяется Si с образованием комплекса ES|, а затем уже Si с образованием полного комплекса, в котором и происходит ферментативное превращение. Схема записывается в виде

*?

? + S, . . ' ES

A'-I

211

к2

ESi + S2 « ¦ : ES1S2

К-2

ESls2 "кат > ? + ? 1 Кинетическое уравнение в этом случае имеет вид ,щ

? = /fKaT[ESiS2].

В случае достаточного избытка субстратов над ферментом концентрация трех-компонентного комплекса может быть выражена через полную концентрацию фермента, полные концентрации субстратов Si и S2, кинетические параметры, условия материального баланса по всем трем ферментным формам Е, ESi и ES1S2 и условия квазистационарности по промежуточным комплексам ESi и ES1S2:

[Е] + [ES,] + [ES,S2] = [E]t,

?? [?] + fc.2[ES,S2] = [ESJ + fc2S2[ES,],

*2s2[ES,] = к-гСЕЗД + ^[ES^].

После несложных алгебраических выкладок получается уравнение для необратимой двусубстратной ферментативной реакции с определенным порядком присоединения субстратов в виде

1 ? 1 1 , + ^'кат 1 | fc-2 + &кат 1 1 k\ S\ k2 s2 k[ k 2 S\ s2

При достаточно больших концентрациях обоих субстратов достигается значение максимальной скорости (^?, равное, как и в случае односубстратной реакции, ^кат[Е]4- Из экспериментально найденной зависимости ? от S[ и s2 могут быть найдены параметры ккат, &r, k-i/kx, т.е. k^ и (к.2 + ккат)/к2. Последняя величина представляет собой константу Михаэлиса для второго субстрата.

Даже простейшее кинетическое уравнение ферментативной реакции содержит несколько кинетических параметров, каждый из которых зависит от температуры и среды, в которой протекает реакция, в первую очередь от рН и ионной силы. Если эксперименты проводятся в присутствии органических растворителей, то кинетические параметры также зависят от природы добавленного растворителя и его содержания в растворе. Характер всех указанных зависимостей различен для разных ферментов. Ниже вкратце рассмотрены вопросы, связанные с влиянием р" раствора и температуры на скорость ферментативных реакций.

Ферменты, как правило, работают в определенном диапазоне рН и характеризуются некоторым оптимальным значением pit, при котором при прочих равных условиях скорость реакции имеет наибольшее значение. Причины такого характера зависимости можно пояснить на примере кинетики гидролиза цитидин-2 ,3 " фосфата, катализируемого панкреатической рибонуклеазой. Как следует из риС-60, изображающего активный центр фермента на второй стадии реакции расшеп" ления РНК, каталитически активной является форма фермента, у которой оста ток имидазола, принадлежащий llis-12, протонирован и способен подать прот0^ на атом 2'-0 циклофосфатного фрагмента, а остаток имидазола, принадлежат^ His-119, не протонирован и способен принять протон у атакуюше"

молекулы воды. Естественно, что ни в существенно кислой среде, когда оба остатка гистидина протонированы, ни в существенно щелочной среде, когда оба остатка лишены протонов, каталитическое превращение осуществляться не будет. Процесс возможен лишь в некоторой промежуточной области, в которой содержание монопротонированной формы достаточно велико.

В общем случае можно высказать следующее положение: каталитически активной является только та часть молекулы фермента, у которой группы, принимающие участие в общем кислотном катализе, протонированы, а принимающие участие в общем основном катализе — не протонированы. Доля каталитически активной формы фермента в связи с этим зависит от рН раствора, и именно это является главным фактором, определяющим влияние рП на скорость ферментативной реакции. В свете сказанного выражение для максимальной скорости реакции можно записать в виде

iWx = tгде kiK^T) — истинная, не зависящая от pit константа скорости каталитического

превращения в комплексе субстрата с каталитически активной формой; —

доля этой формы. Конкретный вид зависимости ас„ — рП зависит от того, сколь-

ко и каких именно групп, состояние протонпрования которых существенно для каталитического превращения, имеется в активном центре фермента. Для случая панкреатической рибонуклеазы эта величина может быть записана в виде

aES

1 + ?·„'+ [Г] + К'

(6.14)

где К'{ и К'г — константы ионизации протонированных имидазольных циклов остатков His-12 и His-119 в составе комплекса фермент — цпклофосфат. Значения соответствующих рА" при 25°С, найденные из экспериментальной зависимости &кат Для гидролиза цитидин-2',3'-циклофосфата, составляют: рА',' = 9,0, \>К'0 = 6,15.

Сходная, хотя и несколько более сложная, картина получается и для зависимости от рН константы Михаэлиса. С учетом активной в связывании субстрата Доли свободного фермента а и доли формы активной в связывании субстрата а„

Условие квазистационарности для комплекса фермент — субстрат можно записать в виде

Л'ист. oES[ES] + ?-·*!. ars[ES] = fcjHCT) «^[Е] [S], (6.15)

где fc(hct) и ?.{ист) _ истинные, не зависящие от рН константы скорости ассоци-

ации и диссоциации комплекса фермент — субстрат. Сопоставление этого выраже-Ния с (6.7) позволяет записать выражение для константы Михаэлиса в виде

/·( ИСТ) _1_ / > ( истI а. а

-? ? ькат "PC aP,S

? ?? S ? S

вести понятие истинной, не зависящей от pit константы Михаэлиса А'мист)

Для случая гидролиза цитпднн-2 '3 '-циклофосфата, катализируемого панкреатической рибонуклеазой, выражения для и имеют вид

1 + Кл+ AV +М

, *c = i + M

где ?? и К~2 — константы ионизации протопироааиных имидазольных колец'His-12 и His-119 в свободном ферменте (??? = 6,15, рА'2 = 5,85); — константа ионизации для некоторой группы субстрата, которая для узнавания ферментом должна находиться в непротонированном состоянии. Насколько можно судить по величине рА* этой группы (4,05), таковой является атом N3 остатка цитозина. Общий вид зависимости Ушх и Кц от рН для этой реакции приведен на рис. 65.

Проведенное рассмотрение показывает, что зависимость кинетических параметров ферментативной реакции от рН позволяет в ряде случаен получить сведения о природе групп фермента, формирующих активный центр фермента.

Влияние температуры на скорость ферментативного превращения в первую очередь определяется зависимостью от температуры отдельных констант скорости, которые обычно достаточно хорошо описываются уравнением Аррепиуса. Для понимания механизма ускоряющего действия ферментов на реакции важной является зависимость от температуры величины klРис. 65. Зависимость Vmax и Км от рН для реакции гидролиза цити-дин-2 ',3 '-циклофосфата, катализируемого панкреатической рибонуклеазой, в координатах Igk^ - рН (где *с = VWix/Mf) и \gKM - рН (по дан-

ным Ефтинка и Билтонена) гидролиза цитидин-2',3'-циклофосфата э

страница 52
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.04.2017)