Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

турный анализ этого комплекса позволил получить важные сведения о строении активного центра фермента и вместе с другими данными сформулировать механизм каталитического действия фермента. Этот механизм хорошо объясняет все основные отличия ферментативного гидролиза от протекающего по сходной схеме щелочного гидролиза. Эти отличия сводятся к следующему: во-первых, процесс, ката-

но ОН

Рис. 59. Схема активного центра рибонуклеазы в форме, благоприятствующей протеканию первой стадии реакции

лизируемый ферментом, протекает с большой скоростью при нейтральных слабощелочных значениях рН, при которых скорость щелочного гидролиза неиз^ меримо мала. В нейтральной среде среднее время превращения цитидин-2' 3 циклофосфата в составе комплекса с ферментом на три порядка меньше, чем время химического превращения того же субстрата в 1М щелочи. Во-вторых нуклеозид, примыкающий к атому ? со стороны 3 '-кислородного атома, в случае ферментативного гидролиза должен быть пиримидиновым нуклеозидом, причем в случае аналогов уридина или цитидина они должны быть по структуре таковы чтобы резко предпочтительной была анти-конформация гликозидной связи- в-третьих, фермент катализирует только гидролиз фосфодиэфирных связей, образованных 3'- и 5 '-гидроксилами соседних нуклеозидных фрагментов, в то время как щелочному гидролизу в равной степени подвержены и связи, образованные 2'- и 5 '-гидроксигруппами; в-четвертых, при гидролизе циклического фосфата фермент дает исключительно 3 '-концевой фосфат, в то время как при щелочном гидролизе в близких количествах образуются 2 '- и 3 '-изомеры.

Все эти особенности получают свое объяснение при рассмотрении активного центра рибонуклеазы, схема которого приведена на рис. 59. Видно, что реакционная часть молекулы, включающая остаток фосфорной кислоты и 2'-гидроксигруппу рибозы, располагается вблизи двух имидазольных колец остатков гистидина, His-12 и His-119 (номера показывают положение соответствующих остатков в полипептидной цепи фермента). Поскольку [>К имидазольных колец незначительно отличаются от 7, протонированная и непротонированная формы обоих колец присутствуют в соизмеримых количествах, т.е. в популяции молекул

S«r123

Ph« 120

ген,

ФУ

СН,

His 119

г. ··'·:&·

СН,

? ?-

1 /'V4

Hit 12

4 ·?

? .О НЧ-СНг-снЖ G|„„

1' IE

Рис. 60. Схема активного центра рибонуклеазы в форме, благоприятствующей протеканию второй стадии реакции

202

фермента в измеримых количествах присутствуют формы со всеми четырьмя мыслимыми распределениями заряженных и незаряженных колец. На рис. 59 приведена форма, которая благоприятствует первой стадии реакции. Заряженный имидазольный остаток His-119 подает протон, необходимый для образования 5'-гидроксигруппы аденозина, а непротонированный IIis—12 отнимает протон от 2'-гидроксигруппы, атакуемой атомом Р. Вероятная схема синхронного смещения электронных пар обозначена на рисунке стрелками. Таким образом, остатки His-12 и His-119 работают в этом процессе соответственно как основной и кислотный катализаторы. На рис. 60 аналогичная схема приведена для второй стадии реакции. Вместо ушедшего из активного центра остатка аденозина на его место попадает молекула воды. Происходит сходный процесс, но теперь His—12 играет роль кислотного, a His-119 — основного катализатора, т.е. рабочей является форма с протонированным His-12 и незаряженным His-119.

В обоих процессах депротонирование и протонирование атома 2 '-0 происходит с участием His-12, который расположен по отношению к остатку рибозы именно со стороны этого атома. Если бы в активном центре оказался такой же динук-леозидфосфат с 2' —» 5'-межнуклеотидной связью, непротонированный имида-золььый цикл His-12 не имел бы контакта со свободной 2'-гидроксигруппой, будучи экранирован от нее фосфоднэфирпым фрагментом. Отсюда проистекает абсолютная специфичность фермента именно к 3 ' —> 5 '-фосфоднэфирпым группам. По этой же причине протопнрованный llis-12 на стадии гидролиза циклофосфата подает протон именно на атом 2 '-0, что приводит к количественному превращению 2 ', 3 '-циклофосфата в 3 '-фосфат.

Чтобы субстрат в активном центре имел необходимую ориентацию относительно каталитических групп, он должен быть фиксирован на ферменте по нескольким точкам. Связывание остатка фосфорной кислоты обеспечивается образованием водородных связей и электростатическим взаимодействием с остатками His-12 и His-119, один из которых протопирован, и с остатком глутамина Glii-11-В связывании гетероцикла участвуют остаток серима Ser-123, остаток фенилала-нина Phe-120, находящийся в частичном стекинге с пиримидиновым кольцом субстрата, и две группы остатка треонина ТЬг—45 — его гидроксигруппа и Nil-группа полипептидного остова. Для такого связывания необходимо, чтобы пи-римидиновый нуклеотид находился в яипш-конформации. Переход в син-конфор-мацию нарушает образование водородных связей с остатком Thr-45, необходимое для правильного закрепления субстрата в активном центре. Размеры области, в которой располагается гетероцикл, недостаточны для размещения в ней пуринового гетероцикла.

Таким образом, установленные экспериментально структура активного центра и схема расположения в нем аналога субстрата логично объясняют все характерные особенности действия панкреатической рибонуклеазы.

Из сказанного видно, что белок, который в данном случае сам по себе является ферментом и не требует участия дополнительных кофакторов, выполняет две главные функции: узнает специфичный субстрат, ориентируя его в составе комплекса нужным образом относительно имидазольных колец двух остатков гистидина, и осуществляет с помощью этих двух остатков, формирующих каталитический центр фермента, общий кислотный и основной катализ на обеих стадиях гидролиза. Эти функции — наиболее общие для всех белков, являющихся ферментами или входящими в их состав.

203

I

сн,

I ?

~ NH—CH— CO—NH—CH—CO~

Asp f 02

S*r 195

-CHl-{ н?ЛЛн

?7

сн, I

~мн—сн-соон

/ HN^HH

"? W

¦о-сн

¦сн,

Рис. 61. Схема активного центра сериновых протеаз и механизм их

действия:

/ - карман, участвующий в опознавании бокового радикала R,;

Помимо кислотно-основного катализа белки могут в отдельных случаях осуществлять нуклеофильный катализ. Наиболее изученной группой белков-ферментов, осуществляющих нуклеофильный катализ, являются довольно многочисленные ферменты, катализирующие гидролиз пептидных связей в полипептидах, относящиеся к так называемым серипооым протеазам. С точки зрения механизма

действия наиболее обстоятельно исследованы три пищеварительных фермента — трипсин, химотрипсин и эластаза. Эти ферменты отличаются лишь специфичностью по отношению к природе аминокислотного остатка, по карбонильной группе которого происходит расщепление полипептидной цепи. В случае трипсина этот остаток должен нести достаточно удаленный от полипептидного остова положительный заряд.

Из природных аминокислот этому условию удовлетворяют остатки лизина и аргинина. В случае химотрипснна этот остаток должен содержать гидрофобный, предпочтительно ароматический радикал. Поэтому расщепление преимущественно проходит по остаткам фенилаланина, тирозина и триптофана. В случае эластазы расщепление проходит, если боковой радикал имеет небольшой размер, главным образом по остаткам глицина и аланина. Эта специфичность определяется структурой полости, в которой размещается боковой радикал атакуемого аминокислотного остатка для осуществления необходимой ориентации относительно каталитического центра фермента.

Каталитический центр для всех трех ферментов представлен тремя главными аминокислотными остатками -¦- серином, гистидином и аспартатом. В случае химотрипснна это остатки Ser-195, His—57 и Asp-102. Схема их взаимного расположения представлена на рис. 61.

Наличие рядом с ОН-группой серина положительно заряженного имидазольно-го кольца резко облегчает ионизацию этой группы серина, так что в значительной, а возможно, и подавляющей части молекул оиа находится в виде соответствующего аниона. Протежирование имидазолыюго цикла His—57 осуществляется с помощью расположенной рядом с ним карбоксильной группы остатка Asp-102. Ионизация резко повышает нуклеофильный характер остатка серина, который атакует пептидную связь с отщеплением С-концевой половины расщепляемого полипептида и образованием продукта ковалентного присоединения его ?-коице-вой половины по остатку Ser-195 в виде ацилфермента. На второй стадии ацил-фермент гидролизуется с отщеплением ?-концевой половины гидролизуемого полипептида и регенерацией активного центра. Схема двустадийного гидролиза пептидной связи сериновыми протеазами, таким образом, может быть записана в виде

^H3CHR1-...-NHCHR?CO-NHCHRt,|CO-...-NHCHRnCOO_ + Н0СНг-Е ->

+

->NH3CHR,-.. -NHCHR?C0-0CH2-E + NH?CHR.t(C0-...-NHCHR„C00- (Е.2)

NH3CHR-...-NHCHRiC0-OCH-E •^^•NH3CHR)—...—NHCHR^ CO0? + H0CH2~E

В большом числе случаев, особенно если речь идет о видах катализа, для осуществления которых белковые молекулы не приспособлены (электрофильный, окислительно-восстановительный катализ), белковые молекулы, составляющие основу фермента, сами по себе, каталитически не активны и становятся катализаторами лишь в сочетании со специальными кофакторами — нонами металлов или сложными органическими молекулами. Последние часто называют простетичес-кими группами, а лишенные кофактора белковые компоненты фермента — апо-ферментами.

В качестве примера фермента, работающего с участием кофактора, на рис. 62 приведена схема активного центра карбоксипептидазы А — пищеварительного

Рис. 62. Схема активного центра карбоксипептидазы А (остаток Туг 198 на схеме не изображен)

фермента, катализирующего гидролитическое отщепление С-концевого аминокислотного фрагмента от полипептидов. Фермент абсолютно специфичен к L-конфи-гурации отщепляемого аминокислотного остатка и резко преимущественно катализирует отщепление остатков гидрофобных аминокислот. Гидролиз в этом случае протекает по механизму электрофильного катализа и требует участия иона цинка — в белке какие-либо группы, способны

страница 50
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(30.05.2017)