Биологический каталог




Биологическая химия

Автор Д.Г.Кнорре, С.Д.Мызина

фермента праймаэи, катализирующего синтез короткого, комплементарного определенному участку матрицы рибоолиго-нуклеотида. Фрагменты, на которых может происходить синтез такого праймера, разбросаны вдоль цепи ДНК с интервалами в среднем в несколько десятков нуклеотидов. После образования праймера включается в работу ДНК-полимераза и начинается синтез запаздывающей нити. Однако он происходит в направлении от вилки репликации, и по мере ее продвижения вновь возникает нереплицированный однонитевый участок материнской цепи — матрицы запаздывающей нити. Лишь после того как перемещение вилки репликации освободит следующий участок, имеющей сродство к праймазе, на ней возникнет новый праймер и начнется синтез нового фрагмента запаздывающей

«"черней «епи цепи. Таким образом, эта

цепь в отличие от ведущей синтезируется в виде фрагментов. Наличие таких фрагментов вновь синтезированной ДНК удалось обнаружить экспериментально. По имени открывшего их японского исследователя они получили название фрагментов Оказаки. Как видно из рис. 52, стадия 4, второй фрагмент Оказаки через некоторое время достигнет 5 '-конца предыдущего фрагмента, который представлен несколькими рибонуклеотидными звеньями. В конечном продукте эти звенья присутствовать не должны. Для удаления таких звеньев в клетках существует по меньшей мере два механизма.

Один из механизмов связан с наличием у ДНК-полимераз (это, во всяком случае, надежно установлено для ДНК-полимераз из Е. coli) дополнительной экзонуклеазной активности, способной катализировать гидролитическое отщепле-

180

ние 5 '-концевого рибо- или дезоксирибонуклеотидного фрагмента, оказавшегося на матрице на пути перемещения ДНК-полимеразы. В результате этой 5' —> 3'-экэонуклеазной активности 5 '-концевые фрагменты бывшего праймера удаляются т. е. ДНК-полимераза в своем стремлении расчистить путь для продвижения вперед убирает рибоолигонуклеотидные фрагменты. Одновременно с этим за счет своей основной активности она застраивает возникающую брешь дезоксирибонук-леотидными остатками. Второй механизм удаления рибоолигонуклеотидных фрагментов основан на присутствии в клетках особой рибонуклеазы, получившей название РНКазы Н. Этот фермент специфичен к двунитевым структурам, построенным из одной рибоолигонуклеотидной и одной дезоксирибонуклеотидной цепи, причем гидролитически расщепляет первую из них. РНКаза ? также способна удалять остатки рибоолигонуклеотидного праймера с последующей застройкой бреши с помощью ДНК-полимеразы.

В итоге фрагменты Оказаки превращаются в цепи, построенные только из дезоксирибонуклеотидов. Однако на стыке двух фрагментов остаются 5 '-концевой фосфомоноэфирный фрагмент первого и 3 '-гидроксигруппа второго фрагмента. Их соединение в единую цепь происходит при помощи еще одного фермента, являющегося обязательным участником репликации, — ДНК-лигазы. Этот фермент катализирует соединение двух фрагментов по реакции, аналогичной описанной в § 4.6 для РНК-лигазы, используя для образования промежуточного смешанного ангидрида с АМФ, который переносится либо от АТФ, либо от NAD+. В последнем случае на первой стадии реакции освобождается не пирофосфат, а никотанамидмононуклеотид. Процесс проходит только в составе двунитевой структуры. Схема процесса может быть представлена в виде

•••pdX,., pdX-OH pdXitl pdXit2pdXio ··· + ??? -^

dX;., pdX(- X?tl PdXj+2pdXit3 ? · · ·

_^ ··· pdX?-_, pdX -OH PdX?+1pdXit2pdX?t3 ··¦ + ? _^

···¦ dXj-ipdXi XitlpdXit2pdXit3p--- (7?)

_^ · ¦ · pdXi-, pdX?- pdXit, pdX?+s pdXi,.3 · ¦ · + рД (АМф)

···¦ dX?_| pdXf pdXi+i pdXi+2 pdXi*3P · ·' где V — цирофосфат или никотинамидмононуклеотид.

Развертывание двунитевой спиральной структуры геликазами не создает каких-либо осложнений, если, как это представлено на рис. 50, концы ДНК свободны. Если же они закреплены, как это, бесспорно, имеет место в кольцевых ДНК и скорее всего у ДНК в хромосомах эукариот, то раскручивание двойной спирали создает в остальной части структуры сверхспирализацию. При этом, поскольку раскручивается правая спираль, возникает и постепенно усиливается положительная сверхспирализация. Это не может не сказываться на протекании процессов в вилке репликации и должно постепенно привести к торможению процесса в целом. Чтобы избежать этого, необходимо введение в сохранившуюся двуспираль-ную структуру отрицательных супервитков. Этот процесс осуществляется с помощью еще одного специального фермента, играющего важную роль в процессе Репликации, — ДНК-топоизомеразы П. Название связано с тем, что единственной функцией этого фермента является введение в двунитевую ДНК отрицатель-

181

?

ных супервитков, т. е. катализ взаимопревращений топологических изомеров ДНК. Это не означает, что действие фермента не сопровождается никакими химическими превращениями. Во-первых, топоизомераза II требует для своей работы затраты энергии, а создание супервитков сопровождается гидролизом АТФ, т.е. фермент является АТФазой. Во-вторых, детальный механизм ее действия включает введение разрыва в одну из полинуклеотидных цепей и воссоединение разорванных фрагментов после их перемещения относительно второй цепи, приводящего к возникновению супервитка.

Таким образом, в репликации ДНК помимо ДНК-полимеразы принимает участие большой набор ферментов: геликаза, праймаза, РНКаза Н, ДНК-лигаза и топоизомераза II. Этим список ферментов и тем более белков вообще, существенных для матричного биосинтеза ДНК, не исчерпывается. Полная картина еще не выяснена. В качестве еще одного достаточно хорошо изученного белка, необходимого для полноценного функционирования системы ферментов, работающих в вилке репликации, можно привести белок, специфично и кооперативно связывающийся с однонитевыми ДНК. Его чаще всего называют белком SSB (single strand binding). В первых работах он фигурировал как ДНК-раскручивающий белок. Белок SSB вследствие сродства к однонитевой ДНК и способности, будучи связанным с полинуклеотидной цепью, интенсивно взаимодействовать с соседними молекулами белка закрывает возникающие при действии геликаз однонитевые участки матрицы, препятствуя их обратной рекомбинации до прихода в эти точки ДНК-полимеразы.

Во всех процессах матричного биосинтеза имеется хотя и малая, но конечная вероятность ошибки системы при отборе мономера и тем самым включения в растущую цепь биополимера мономерного фрагмента, не соответствующего кодирующему его элементу матрицы. Такие ошибки особенно нежелательны в случае репликации, так как если ошибочно включенный в дочернюю цепь нуклеотид сохранится до следующего цикла репликации, искаженная информация будет передана следующему поколению и практически необратимо унаследована. Сам по себе отбор матрицей дезоксинуклеозид-5 '-трифосфатов требуемой точности не обеспечивает, и система репликации требует наличия дополнительного корректирующего механизма. Эту роль выполняет присущая ДНК-полимеразам 8'—» 5'-экэонуклеаэная активность, катализирующая гидролитическое отщепление 3'-концевого звена растущей цепи в ее комплексе с матрицей. Скорость гидролиза особенно велика в случае, если включенный в растущую цепь остаток не комплементарен кодирующему нуклеотиду матрицы. При этом скорость основной ДНК-полимеразной реакции и 3'—> 5 '-экзонуклеазного гидролиза сбалансированы таким образом, что если в присутствии достаточных концентраций всех четырех субстратов присоединится нуклеотид, комплементарный соответствующему звену матрицы, то резкое преимущество перед гидролизом будет иметь присоединение следующего звена цепи. Если присоединится ошибочный, некомплементарный нуклеотид, то вероятность гидролиза существенно превысит вероятность следующего акта элонгации. В результате не комплементарный кодирующему элементу матрицы остаток нуклеотида имеет не только резко пониженную по сравнению с комплементарным вероятность быть встроенным в растущую цепь, но и резко повышенную вероятность быть удаленным в результате действия 3'—> 5 '-экзо^ нуклеазной активности до того, как сможет пройти следующий акт элонгации. Ш

182 Я

5.5. БИОСИНТЕЗ РНК (ТРАНСКРИПЦИЯ)

Матричный биосинтез РНК осуществляется с помощью ферментов, называемых РНК-полимеразами или, более развернуто, ДНК-зависимыми РНК-полимера-зами. Эти ферменты катализируют реакцию, совершенно аналогичную реакции (V.2), катализируемой ДНК-полимеразами, с той лишь разницей, что ее участниками являются четыре рибонуклеозид-5 '-трифосфата, три из которых содержат те же гетероциклы, что и субстраты синтеза ДНК, а один — уридин-5 '-трифос-фат, выступающий в качестве рибоаналога дезокситимидин-5 '-трифосфата, используемого в процессах репарации и репликации, вместо тимина содержит урацил:

...pXi-i pXi - ОН + pppXi»! - ОН + ...pIH рХ, piw - ОН + РР* (V.5)

В соответствии с этим уравнением РНК-полимеразы, как и ДНК -полимеразы, относятся к классу трансфераз и являются нуклеотидилтрансферазами. Сопровождающий присоединение каждого нуклеотидного остатка к растущей цепи разрыв пирофосфатной связи в субстрате обеспечивает отрицательное значение ?(? в процессе поликонденсации.

Матрицей при транскрипции служит двунитевая ДНК. Имеется много экспериментальных данных, свидетельствующих, что вблизи активного центра РНК-полимераз происходит локальное расплетание двунитевой структуры, и одна из освободившихся нитей принимает участие в отборе комплементарных субстратов в каждом акте роста полинуклеотидной цепи. Однако по мере продвижения фермента относительно матрицы прочитанная цепь, которую называют транскрибируемой, вновь объединяется с нетранскрибируемой нитью, и прошедшая через контакт с ферментом ДНК остается двунитевой. РНК-Продукт, который часто называют транскриптом, получается в виде однонитевой структуры, (рис. 53). Последовательность нуклеотидов транскрипта аналогична последовательности соответствующих остатков в нетранскрибируемой цепи, с той лишь разницей, что во всех звеньях транскрипта присутствуют остатки рибозы вместо остатков дезок-сирибозы у матрицы и в местах, где звенья матрицы содержат тимин, звенья транскрипт

страница 44
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Биологическая химия" (8.81Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(13.12.2017)