ьного и полного изучения этих первичных эффектов.

Структура хлоропласта

Оболочка хлоропласта является в настоящее время предметом интенсивного изучения. Предстоит решить вопрос: какие особенности структуры и связанных с ней ферментов обеспечивают выполнение характерных функций? Все более понятной становится молекулярная структура мембран тилакоидов — ориентация и распреCFf(ATPa3a)

ФС И tpc I GF0 (АТРаза)

БНУТРИТИЛАКОИДНОЕ ПРОСТРАНСТВО

Рис. 8.1. Упрощенная схема расположения полипептидных компонентов мембраны хлоропластов, построенная на основе данных о цепи переноса электронов и их ориентации в мембраны. Обозначения: ССК — светособирающий комплекс; ХЛ — хлорофилл; Цит — цитохром; Фд — ферредоксин; Пс — пластоцианин; CF — сопрягающий фактор; а, ($, у, б, е, I, II — субъединицы сопрягающего фактора, фд—Р — ферродексин ?— NADP+'редуктаза. [Печатается с любезного разрешения проф. Д. фон Веттштейна (D. von Wettstein), Carlsbarg Laboratories, Copenhagen).]

деление в них липидов, белков, пигмент-белковых комплексов и т.п. (рис. 8.1). Пока еще не ясно, каков механизм упаковки мембран в граны и каково его биохимическое и физиологическое значение. С вопросом об образовании гран в некоторой степени связана и проблема взаиморасположения фотосистемы I и фотосистемы II в мембранах стромы и гран.

Происхождение и развитие хлоропластов

Откуда произошли хлоропласты водорослей и высших растений (эукариот)? Согласно эндосимбиотической теории эволюции эукариот, хлоропласты ведут свое начало от прокариотических клеток — цианобактерий (сине-зеленых водорослей). Верна ли эта теория? Можно ли считать, что сине-зеленые водоросли (симбиотические водоросли; см. рис. 3.5), обнаруживаемые в некоторых облигатных фотоавтотрофах, например в Cyanophora sp.. (жгутиковой водоросли, содержащей сине-зеленую водоросль в качестве симбионта), являются современными представителями звена, лежащего в эволюционном ряду между сине-зелеными водорослями и хлоропласта-ми? Накапливается все больше данных в пользу близкого сходства между сине-зелеными водорослями и хло-ропластами эукариот.

Другое направление исследований, активно ведущихся в настоящее время, — это 1) синтез и сборка компонентов хлоропласта, 2) вопрос о том, синтез каких компонентов направляется геномом самого хлоропласта и каких компонентов—ядерным геномом клетки. Каким образом синтезированные в цитоплазме компоненты переносятся в хлоропласт и встраиваются в его мембраны; как из протопластид выращенных в темноте растений и водорослей образуются при освещении зрелые пластиды и тилакоиды?

Генетика

В настоящее время изучение молекулярной генетики хлоропласта интенсивно развивается. Расширились наши представления о хлоропластной ДНК, о местах синтеза и транслокации хлоропластных белков, о регуляции синтеза белков и т. д. В будущем это поможет нам управлять реакциями фотосинтеза на уровне хлоропластов,. листьев и целых растений. Генетические аспекты изучения сине-зеленых водорослей (цианобактерий) и фотосинтезирующих бактерий и выяснение роли ллазмид представляются также очень интересными, поскольку все эти организмы являются бактериями, и в работе с ними можно использовать те же генетические методы и подходы, которые уже хорошо разработаны для других: прокариотических организмов.

Последовательности транспорта электронов при циклическом и нециклическом фотофосфорилировании

Приведенные в этой книге схемы, разумеется, нельзя рассматривать ни как полные, ни как безупречно точные. Изучение кинетических характеристик реакций индивидуальных компонентов и выяснение роли пока еще не обнаруженных компонентов могут существенно изменить наши представления. До сих пор мало изучены реакции выделения кислорода в фотосистеме II, первичные акцепторы электронов, состав реакционных центров. Активно исследуются важные вопросы, касающиеся ориентации отдельных компонентов мембраны. Значительный интерес представляет роль большого пула пласто-хинонов между фотосистемой II и фотосистемой I.

Транспорт ионов

Участие хлоропластов в «перекачке» различных катионов, например Са2+, Na+, К+, и анионов, например РО4 , О-, вносит важный вклад в общий процесс переноса и накопления ионов в клетке. Точный механизм этого явления еще не установлен.

Кроме того, под действием света такие ионы, как Mg2+ и Н+, переносятся через мембрану тилакоида, принимая участие в механизмах регулирования фиксации С02 и возникновения поверхностного заряда на самих мембранах. Какова роль этого перемещения ионов, пока еще не ясно.

Механизм образования АТР

Связь между протонным насосом, создающим трансмембранный градиент концентрации Н+, и образованием АТР (хемиосмотическая гипотеза Митчелла) активно изучаетс-я на самых разнообразных объектах — мутантах водорослей, целых и лопнувших хлоропластах, препаратах субхлоропластных мембран. При этом исследуется влияние сопрягающих факторов и АТРаз, антител, ингибиторов и разобщителей, регуляторов электронного транспорта и т. п. Локализация образования АТР точно еще не установлена. Обнаружены два участка, связанных с фотосистемами I и II, в которых синтез АТР сопряжен с транслокацией протонов. До сих пор не установлена точная стехиометрия процесса фотофосфори-лирования, т. е. отношение NADPH/ATP. Иначе говоря, неизвестно, чему равно отношение АТР/2е_ (1,0, 1,33 или 2,0?), а это очень важное значение, поскольку, получив ответ на этот вопрос, можно узнать, сколько квантов необходимо для фиксации одной молекулы С02. Значительные успехи достигнуты в изучении структуры АТРазы — 5 белковых субъединиц этого фермента показаны на рис. 8.1. Постепенно выявляются и свойства этих субъединиц—cnoqo6HOCTb к связыванию с мембраной, ингибиторная активность, протонный обмен, связывание фосфатов и т. п.

Выделение кислорода в фотосистеме II

Эта важнейшая реакция фотосинтеза у всех растений остается до сих пор одной из самых больших загадок. Однако исследования, проводимые в .последние годы, помогают понять природу механизма, обусловливающего разложение воды и высвобождение кислорода, протонов и электронов. Был выделен белковый комплекс фотосистемы II, при добавлении которого к лишенным его мембранам липосом восстанавливалось выделение кислорода. Роль марганца в этом процессе пока еще установить не удается, поскольку существует по меньшей мере два пула марганца и исследовать их методами спектрофотометрии очень трудно. Не установлена также последовательность актов поглощения света,

окисления S-состояний, выброса протонов и выделения кислорода. Вместе с тем имеются успехи в изучении взаимной ориентации компонентов фотосистемы II в мембране — показано, что выделение кислорода и высвобождение протонов происходят на внутренней поверхности мембраны тилакоида.

Моделирование фотосинтеза

Фотохимики и фотобиологи настойчиво ищут искусственные системы, способные расщеплять воду за счет солнечной энергии. В синтетические мембраны, приготовленные из липосом, можно встраивать пигменты, белки и другие молекулы, способные поглощать свет и осуществлять транспорт электронов. Специально синтезируются различные соединения марганца и исследуется их способность катализировать разложение воды. Изготовлены различные полупроводниковые катализаторы, содержащие рутений и (или) титан и способные при освещении выделять молекулярный кислород из воды. Исследуются также искусственные системы, способные к фотовосстановлению С02 с образованием муравьиной кислоты и метилового спирта. Ферредоксин, используемый для моделирования системы хлоропластной мембраны, в присутствии гидрогеназы и платины может восстанавливаться на свету с образованием молекулярного водорода из воды. Преимущество подобных искусственных систем по сравнению с природными системами фотосинтеза состоит в том, что их можно оптимизировать, добиваясь максимальной эффективности фотосинтеза, которая в данном случае не лимитируется физиологическими свойствами и потребностями целого растения.

9. Лабораторные работы

9.1. Связь между содержанием хлорофилла,

синтезом крахмала и фиксацией С02

а. Взять пестрые листья Pelargonium или Coleus. Определить крахмал по реакции с иодом или определить

интенсивность фоторинтеза с помощью метода, основанного на использовании высечек из листьев (Page,

с. 45).

б. Взять растения, выросшие на свету, и растения, выросшие в темноте. Определить крахмал по реакции с

иодом после экстракции метанолом (Bowen, с. 147).

в. Убедиться в необходимости С02 для синтеза крахмала. Взять растения, выращенные с С02 и без С02, и

определить в них крахмал по реакции с иодом (Page, с. 44).

г. Установить зависимость между концентрацией бикарбоната в растворе и скоростью фотосинтеза. Метод с использованием высечек из листьев (Page,

с. 45).

9.2. Фотосинтез у Etodea

и одноклеточных водорослей

а. Выделение кислорода при фотосинтезе у Etodea. Исследовать влияние интенсивности света и температуры. Измерить количество выделенного кислорода с

помощью микробюретки Аудуса (Audus) (Machlis,

Тоггеу, с. 132).

б. Потребление С02 Elodea. Определить, зависит ли

данный процесс от света. Использовать краситель-индикатор бромтимоловый синий, чтобы измерить потребление С02 (Bowen, с. 147).

в. Выделение 02 одноклеточными водорослями, например Chtoretla, Scenedesmus. Измерить количество

выделенного кислорода с помощью манометра Варбурга (Dunn, Arditti, с. 36).

9.3. Разделение и хроматография

пигментов хлоропластов

а. Экстрагирование пигментов ацетоном. Разделение в

петролейном эфире и метанола (Machlis, Torrey,

с. 136).

б. Колоночная хроматография экстрактов из листьев.

Порошок окиси магния; обработка летролейным эфиром и бензолом (Machlis, Torrey, с. 138).

в. Колоночная хроматография экстракта водорослей.

Абсорбент — трикальцийфосфат, обработка фосфатным буфером рН 6 (Dunn, Arditti, с. 36).

г. Тонкослойная хроматография. Силикагель на стеклянной подложке; обработка петролейным эфиром и

ацетоном (Bowen, с. 129).

9.4. Реакция Хилла в выделенных хлоропластах

а. Восстановление красителя дихлорфенолинд