действие ультразвука малой интенсивности и т. д. В результате такой обработки можно наблюдать подавление той или иной реакции переноса электронов, а последующее добавление очищенного экстрагированного компонента приводит к восстановлению процесса электронного транспорта в мембранах хлоропластов. Опыты такого рода были успешно проведены с пластохиноном, пласто-цианином, ферредоксином, а также с ферментом (фла-вопротеидом), переносящим электроны от ферредоксина к NADP+. Результаты этих опытов дают дополнительные сведения о взаимном расположении переносчиков электрона.

Измерения электронного парамагнитного резонанса при низких температурах (от 4 до 78 К), проведенные в последнее десятилетие, .позволили выяснить роль многих парамагнитных центров в хлоропластах как компонентов электрон-транспортной цепи. Использование такого подхода вместе с измерениями окислительно-восстановительного потенциала в анаэробных условиях позволило установить расположение в электрон-транспортной цепи хлоропластов таких переносчиков электронов, как железо-серный центр Риске (Rieske), обозначаемый Fe-SR, железо-серные центры Fe-SA и Fe-SB> а также центр X, точная природа которого пока еще не установлена, хотя есть основания думать, что он представляет собой Fe-содержащий хинон. Ни один из этих переносчиков ещене удалось пока выделить из мембран в чистом виде. Точная последовательность переносчиков на участке от X до ферредоксин а пока еще не известна. Возможно, что между Р700 и X имеется еще один переносчик электронов.

В изящных опытах, проведенных Левином (Levine), Бишопом (Bishop) и другими исследователями с использованием мутантов зеленой водоросли Chlamydomonas, также были получены данные, свидетельствующие о последовательности переносчиков электронов, показанной на рис. 5.2. Были получены мутанты этой водоросли, дефектные по разным участкам электрон-транспортной цепи, например мутанты с подавленным переносом электрона между пластохиноном и цитохромом Ь или между пластоцианином и цитохромом f. Точное знание участка, в котором блокирован перенос электронов, дает возможность добавлять электроны в электрон-транспортную цепь или удалять их из нее в разных участках. Этого сравнительно легко добиться, пользуясь различными красителями; такой подход успешно применяется в упомянутых выше спектрофотометрических исследованиях. Перечисленные генетические и биохимические эксперименты по идее своей подобны тем опытам, которые проводились на плесневом грибе Neurospora и на бактерии Escherichia coll. Результаты проведенных опытов подтвердили последовательность расположения переносчиков электронов в нециклической цепи. Кроме того, они имеют большое значение для анализа данных по фото-фосфорилированию и фиксации СО2, к которому мы перейдем ниже.

Использование химических ингибиторов, избирательно подавляющих биохимические реакции, — это классический и плодотворный подход к изучению биохимических механизмов. Ингибиторы успешно применялись и при исследовании нециклического фотофосфорилирова-ния. Были найдены различные ингибиторы, блокирующие отдельные участки этой цепи; например ДХММ [3- (3,4-дихлорфенил)-1, 1-диметилмочевина] — гербицид, блокирующий выделение кислорода; антимицин А — антибиотик, подавляющий восстановление цитохрома /; ДСПД (дисалицилидинпропандиамин), блокирующий перенос электронов, катализируемый ферредоксином.

Наконец, следует рассмотреть образование АТР, сопряженное с нециклическим переносом электронов. В 1958 г. Арнон, Уотли и Аллен показали, что синтез АТР должен обязательно быть сопряжен с восстановлением NADP+, и обнаружили, что скорость переноса электронов на NADP+ зависит от присутствия ADP и Pi (необходимых компонентов для синтеза АТР). В связи с фиксацией СОг в темновых реакциях важное значение приобретает вопрос о том, сколько молекул АТР синтезируется в расчете на 1 молекулу образовавшегося NADPH. Дело в том, что для восстановления 1 молекулы С02 до уровня углеводов в темновых реакциях нужны 2 молекулы NADPH и 3 молекулы АТР. Получается, что число молекул АТР, приходящихся на 1 молекулу NADPH, должно лежать в интервале между 1 и 2. Согласно современным представлениям, механизм сопряжения электронного транспорта с образованием АТР должен использовать состояния с выфкой энергией и так называемые «сопрягающие факторы», т. е. особые белки, связанные с мембраной хлоропласта.

Митчелл (Mitchell) выдвинул «хемиосмотическую» гипотезу для объяснения синтеза АТР на мембранах. Согласно Митчеллу, образование АТР происходит в результате рекомбинации положительных и отрицательных зарядов, которые накапливаются по разные стороны мембраны гран при переносе электронов по электрон-транспортной цепи. Для этого нужно, чтобы мембраны имели определенную ориентацию, т. е. были бы способны разделять заряды (рис. 5.2, Б). Гипотеза Митчелла привлекательна своей общностью, поскольку она предложена для описания любых биологических мембран, а мембраны хлоропластов действительно подобны другим мембранам, участвующим в синтезе и гидролизе АТР, например мембранам митохондрий (см. Tribe, Whittaker, 1981).

При выделении хлоропластов из целых листьев очень легко нарушить те условия, которые необходимы для синтеза АТР. Поэтому в опытах по фотофосфорилирова-нию требуется большая осторожность, чем в тех экспе

риментах, в которых измеряют только электронный транспорт. На рис. 5.4 показана последовательность действий, необходимых для получения хлоропластов и для измерения выделившегося кислорода и синтезированных при нециклическом фотофосфорилировании АТР и NADPH (см. также гл. 3).

5.4. Циклический транспорт электронов и фосфорилирование

В результате данного процесса, происходящего в хлоропластах под действием света, образуется один-единственный продукт — АТР. Циклическое фотофосфорилирова-ние было открыто в 1954 г. Арноном, Алленом и Уотли на изолированных хлоропластах шпината и Френкелем (Frenkel) на хроматофорах, выделенных из фотосинтеЦентрифужная пробирка _ Профильтрованный гомогенат

Сосуд со льдом

. . Надосадочная жидкость (от-I Н—браоывается)

L^L_ Хлоропласты (осадок)

Стеклянная палочка

Ресуспенди-рованные хлоропласты

Объединенная суспензия хлоропластов

зирующих бактерий. Проще всего описать этот процесс уравнением

Свет

ADP + Р;

Хлоропласты

АТР.

Шприц для отбора образцов из реакционной смеси для анализа NADPH и АТРГ*

Хлоропласты в реакционной

Выделение 02 регистрируется на диаграммной ленте

Момент включения света

Д

Кислородный электрод (см, также рис 2.2)

^СвеГ

Монохроматор Лампа

с длинои волны 340 нм

Кювета с образцом хлоропластов,

взятым из кисло- фотоЛриемник родного электрода^(фотоу^ножитель,

Гальванометр,

©

регистрирующий поглощение света 340 нм

Прерыватель, разделяющий свет на два пучка

Контрольная кювета

Усилитель

Схема спектрофотометра для измерения количества NADPH по поглощению

\

Внесение образца хлоропластов / Центрифугирова11 I ния для осаждеJI ния белков

Оценка образования АТР

У~— Охлажденная трихлоруксус-иая кислота С1%).

Ж

Определение количества АТР по методу 32Р или по методу Pj

Добавление „магиезиевой'

Ч

смеси для осаждения

О

Т;

LJ_ фильтрат,

Рис. 5.4. Схема опыта, демонстрирующего фотосинтетическое выделение Ог, восстановление NADPH и образование АТР выделенными хлоропластамн шпината.

Для синтеза АТР в этом случае нужен только циклический транспорт электронов, запускаемый фотосистемой I. Из схемы, приведенной на рис. 5.2,Л, видно, как это может происходить. Под действием света пигмент Р70о переходит в возбужденное состояние и отдает свой электрон. Этот электрон попадает сначала на железо-серные центры, а затем на ферредоксин, который при этом восстанавливается. Однако в отличие от того, что происходит при нециклическом переносе электронов, в данном случае восстановленный ферредоксин не переносит свой электрон на NADP+, а отдает его цитохрому Ъ, откуда он по цепи переносчиков вновь возвращается на Р70о. Таким образом, электрон проделывает циклический путь, единственным измеримым .продуктом которого является АТР. Образование АТР обеспечивается механизмом сопряжения, подобным, возможно, тому механизму, который действует при нециклическом фотофос-форилировании, хотя переносчики электронов! в двух этих случаях могут быть неидентичными. Число молекул АТР, образующихся при переносе одного электрона, до сих пор не определено. Причина в том, что из двух необходимых величин относительно легко измерять только количество АТР, синтезированного за какой-то промежуток времени, тогда как оценить число электронов, перенесенных по циклической цепи за тот же промежуток времени, не так просто.

Итак, мы видим, что ферредоксин может играть ключевую роль в процессе фотосинтеза. Он может отдавать электроны в нециклическую цепь на NADP+, что приводит к образованию сильного восстановителя NADPH, необходимого для восстановления С02. Ферредоксин может также отдавать электроны в циклическую цепь переносчиков, в результате чего получается только АТР. Синтезированный АТР может использоваться либо для фиксации СО2, либо в других процессах, в которых он играет роль единственного источника энергии, например в синтезе белка и в превращении глюкозы в крахмал — оба этих процесса протекают в хлоропластах. Очень интересны и физиологический механизм, управляющий работой ферредоксина, и свойства самого этого белка, имеющего очень низкий окислительно-восстановительный потенциал, — 0,43 В, примерно равный потенциалу газо

образного водорода. Неудивительно поэтому появление множества работ по изучению физико-химических свойств ферредоксина. Модель его активного центра показана на рис. 5.5.

Цнстеин

t

Цистеки I

Цистеин IЦистеин

В хлоропластах ферредоксин, возможно, служит физиологическим переносчиком (или кофактором), участвующим в циклическом фосфорилировании. Однако в

Присоединение одного электрона

I Белковая цепь 1(97 аминокислот-| ных остатков)

Окисленный ферредоксин

Восстановленный ферредоксин

Рис. 5.5. Модель активного центра ферредоксина раст