ли сконструированы рекомбинантные векторы SV40, несущие ген cat (рис. 8, Б), для оценки силы различных эукариотических промоторов [46, 47]. САТ-система была недавно использована также для изучения специфичности энхансерных после-

40

Глава 1

довательностей ДНК SV40 и вируса мышиной саркомы Молони по отношению к кругу хозяев [48]. При этом применялся анализ временной экспрессии.

3.1.5. Ксантин-гуанин — фосфорибозилтрансфераза [XGPRT]

Ген gpt ?. coli кодирует фермент ксантин-гуанин—фосфо-рибозилтрансферазу (XGPRT)—бактериальный аналог фермента HGPRT млекопитающих. XGPRT с высокой эффективностью катализирует превращение ксантина в ХМР — предшественник GMP, в то время как HGPRT утилизирует только гипо-ксантин и гуанин. Ген gpt ?. coli был клонирован Муллиганом и Бергом [49] в векторе замещения поздних генов SV40 (рис. 8, В). Клетки обезьяны, инфицированные рекомбинантным вирусом, экспрессировали ген gpt ?. coli. Продукт этого гена отличался от эндогенного фермента млекопитающих тем, что он был устойчив к ингибированию гипоксантином и имел другую электрофоретическую подвижность [49].

Способность гена gpt ?. coli экспрессироваться в клетках млекопитающих позволила Муллигану и Бергу разработать систему положительной селекции [50]. Микофеноловая кислота является ингибитором ???-дегидрогеназы, блокирующим превращение IMP в ХМР и, следовательно, подавляющим синтез GMP de novo. Это ингибирование можно еще более усилить, если в среду добавить аминоптерин, который также блокирует синтез IMP. Клетки млекопитающих могут расти в присутствии этих двух ингибиторов, если в среду добавлены гуанин и гипо-

Таблица 15. Отбор g-рг-трансформантов [50]

1. Посейте ~Ы06 реципиентных клеток на чашку Петри диаметром 10 см. Проинкубируйте при 37 °С 24 ч.

2. Проведите трансфекцию культур с помощью рекомбинантной плазмидной ДНК Е- coli, несушей ген gpt, пользуясь кальций-фосфатной методикой (табл. 1, пп. 1—7).

3. Замените среду на свежую, предварительно подогретую среду и проинкубируйте при 37 °С в течение 3 сут для того, чтобы прошла предселективная экспрессия.

4. Трипсинизируйте клетки и посейте по 5-Ю5 клеток на чашку Петри (диаметром 10 см) в среде Игла, содержащей диализованную сыворотку плода коровы в концентрации 10%, ксантин (250 мкг/мл), гипоксантин (15 мкг/мл), тимидин (10 мкг/мл), аминоптерин (2 мкг/мл), микофеноло-вую кислоту (25 мкг/мл) (Eli-Lilly Co.). Проинкубируйте клетки при 37 °С 24 ч.

5. Замените культуральную среду на свежую среду, содержащую такие же добавки, и обновляйте ее каждые 3 сут.

6. Через 2 нед можно будет выделить колонии с помощью специальных цилиндров для клонирования — так, как это описано в табл. 1, п. 11. Число ?/з/-трансформантов можно определить после фиксации в метаноле и окрашивания с помощью 10%-ного красителя Гимза (табл. 1, сноска 4).

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

4f

ксантин или аденин; с помощью дополнительного метаболического пути фосфорибозилтрансферазы могут катализировать превращение этих оснований в соответствующие мононуклеоти-ды. Ингибирование не снимается, если в среду внесены аденин и ксантин, так как HGPRT млекопитающих не может превращать ксантин в ХМР, и поэтому GMP не образуется. Однако, если в клетках млекопитающих происходит экспрессия gpt-reaa ?. coli, рост на среде с аденином и ксантином не подавляется. Как и в случае устойчивости к генетицину (разд. 3.1.3), gpt-ce-лекцию можно проводить на клетках любого типа. Для нему-тантных клеток процедура такого отбора описана в табл. 15. Однако, когда в качестве реципиентов' используются HGPRT--клетки (разд. 3.1.2), для выделения ?р/-трансформантов достаточно провести НАТ-отбор (табл. 1).

3.1.6. Дигидрофолатредуктаза [DHFR]

В качестве селектируемого маркера можно использовать также ген dhfr мыши, имея в виду, что клеточная дигидрофолатредуктаза ингибируется метотрексатом. Введение в клетку модифицированного dhfr-геяа или увеличенного числа копий нормального гена приводит к повышению устойчивости к мето-трексату. d/i/r-кДНК мыши была клонирована в векторе замещения поздних генов SV40, а также в плазмидных векторах серии pSV [51] (рис. 8, Г). Трансфекция клеток яичника китайского хомячка (СНО) этими рекомбинантами и отбор DHFR+-^eTOK по их способности расти на среде с метотрексатом описаны в табл. 16.

Таблица 16. Селекция d/г/г-трансформантов [51]

1. Посейте по ~Ы0в DHFR~-^ieTOK СНО на чашку Петри (диаметром 10 см) за 12—18 ч до трансфекции.

2. Проведите трансфекцию клеток рекомбинантной плазмидой, . содержащей ген dhfr, пользуясь кальций-фосфатной методикой (табл. 1, п.п. 1—7) с периодом абсорбции 8 ч.

3. Проинкубируйте клетки в неселективной среде Хэма F12 при 37 °С 3 сут, чтобы прошла предселективная экспрессия.

4. Трипсинизируйте клетки и рассейте половину содержимого каждой чашки со сплошным монослоем на селективную среду Хэма F12, содержащую 0,2 мкг/мл метотрексата, на 5 новых чашек (диаметром 10 см). Проинкубируйте чашки при 37 °С 24 ч.

5. Замените среду на свежую селективную среду, содержащую такие же добавки, и обновляйте ее каждые 3 сут.

6. Через 2 нед1 можно будет выделить индивидуальные колонии с помощью специальных цилиндров для клонирования (табл. 1, л. 11).

1 На этом этапе при необходимости можно вести непрерывный подсчет клеток пу. тем их окрашивания и фиксации в некоторых из чашек, как это описано в табл. ?, сноска 4.

42

Глава 1

Использование в качестве селективного маркера гена dhfr имеет то преимущество, что трансформированные клетки продуцируют очень большое количество DHFR дикого типа, поскольку происходит амплификация генов [51], а амплифици-руемый участок хромосомной ДНК весьма велик, в него входят протяженные последовательности, фланкирующие ген dhfr [52]. Кауфман и Шарп [53] сконструировали гибридные гены dhfr, соединенные с геном SV40; получившиеся рекомбинанты перенесли в DHFR~-KfleTKH СНО, а затем провели селекцию по способности к росту в присутствии метотрексата. В этих условиях были получены линии, в которых более 10% суммарного растворимого белка было представлено полипептидом, родственным малому ?-антигену SV40. Когда в качестве донорной ДНК использовался мутантный доминантный ген dhfr, необходимость в DHFR~-peHHnHeHTHbix клетках отпадала, поскольку по этому гену можно было проводить прямой отбор [32]. Был также клонирован прокариотический ген DHFR, использованный для индукции устойчивости к метотрексату в клетках мыши [54].

3.2. Доминантные трансформирующие гены, изменяющие регуляцию роста

Перенос генов с помощью ДНК стал одним из важнейших методов идентификации и анализа ряда вирусных и клеточных генов, изменяющих рост и морфологию клеток. В принципе трансформацию этими генами можно выявить в исследованиях двух типов, основанных на «спасении» культуры от старения или на выявлении маркеров «второй стадии» трансформации.

3.2.1. «Спасение» культуры от старения

Это исследование основано на том, что большинство первичных культур клеток млекопитающих перестают делиться, т. е. «стареют», пройдя определенное число пассажей. В некоторых случаях «старение» таких клеток можно предотвратить, подвергнув их различным воздействиям, например, с помощью вирусов или вирусных генов [55, 56]. Получить такую трансформацию клеток с помощью хромосомной ДНК пока не удалось, хотя ранее высказывалось предположение [57], что это возможно, если использовать целые хромосомы.

3.2.2. Маркеры «второй стадии» трансформации

Этим способом можно выявить среди реципиентных клеток такие, у которых изменен фенотип: морфология, способность к росту на полужидком агаре и индукция опухолей у животных [58—62]. Используемые в таких экспериментах реципиентные

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

43

Таблица 17. Перенос с помощью ДНК клеточных онкогенов в клетки NIH3T3

1. Посейте 1,5-105 клеток NIH3T3 во флакон (площадь роста 25 см2) с 10 мл среды Хэма SF12, содержащей сыворотку плода коровы «Hyclone» в концентрации 15%, и проинкубируйте при 37 °С.

2. Через 24 ч инкубации приготовьте копреципитат ДНК — фосфат кальция, используя донорную ДНК (см. табл. 1, пп. 4—6), и добавьте по 1 мл на флакон с клетками.

3. Через 24 ч инкубации клеток с ДНК замените среду на свежую.

4. Еще через 24 ч. поменяйте среду в соответствии с одной из следующих прописей:

а. Среду с низким содержанием сыворотки (среда Хэма SF12, содержащая 5% сыворотки «Hyclone») меняйте каждые 3—4 сут в течение 2— 3 нед. Образование фокусов должно наблюдаться через 10 сут после: трансфекции.

б. Трипсинизируйте клетки и посейте их на среду Хэма SF12, содержащую сыворотку «Hyclone» (30%), с добавлением метоцеля (0,9%) и агара (0,6%). Колонии трансформированных клеток можно будет обнаружить через 7—10 сут после трансфекции.

в. Трипсинизируйте клетки и инъецируйте по 1·—2-106 клеток каждому из нескольких экспериментальных животных (например, «голым» мышам). Опухоли должны появиться в месте инъекции через 2—10 нед в зависимости от донорной ДНК.

клетки обычно представляют собой перевиваемые линии фибро-бластов грызунов, которые способны эффективно поглощать и экспрессировать экзогенную ДНК при трансфекции кальций-фосфатным методом. Это фибробласты NIH3T3, крысиные эмбриональные фибробласты Фишера, клетки СНО и С13-клон клеток ВНК [58—62].

Недавно клетки NIH3T3 были использованы для идентификации и анализа активированных трансформирующих генов (онкогенов), присутствующих в разных опухолевых клетках [63—67]. Они с легкостью поддаются трансфекции, и вместе с тем у них часто наблюдается «вторая стадия» трансформации.. Процедура анализа трансформирующих генов, присутствующих в суммарной ДНК опухолевых клеток, описана в табл. 17. Отметим, что популяции клеток NIH3T3 могут быть очень гетеро-генны. Клоны, полученные в разных лабораториях, различаются по таким фенотипическим свойствам, как способность расти на определенной среде, потребность в сыворотке, способность к трансформации и уровень спонтанных трансформантов. Поэтому необходимо тщательно проверить все эти параметры, прежде че