Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

собой весьма эффективный метод фракционирования ооцита в тех случаях, когда предполагают, что белок, кодируемый инъецированной мРНК, переносится в ядро. Описанные ниже методы занимают немного времени и позволяют собрать ядра и энуклеированные ооциты для дальнейшего анализа. Они не подходят, если планируются инъекции в безъядерные ооциты; в этих случаях используют методы Форда и Гердона [75].

6.1.1. Метод 1

1. Осторожно придержите ооцит часовым пинцетом в модифицированном солевом растворе Барта так, чтобы пигментированная половина находилась вверху.

2. Сделайте надрез в верхней точке пигментированной половины кончиком иглы № 23. Проследите, чтобы надрез был неглубоким.

3. Осторожно сожмите ооцит в его средней части. Сферическое прозрачное ядро диаметром около 0,3 мм выдавится нару-

Трансляция эукариотической мРНК в ооцитах Xenopus

35?

Рис. 12. Энуклеация ооцитов. Показаны этапы энуклеации методом 1 (разд. 6.1.1). На верхушке пигментированной половины ооцита делают поверхностный надрез с помощью иглы № 23. После этого осторожно сжимают ооцит в экваториальной области; ядро постепенно выдавливается наружу (А) и в конце концов полностью высвобождается (Б).

358

Глава 10

жу (рис. 12). Нуклеоплазма имеет вид геля, и если энуклеацию проводят слишком грубо, видно, как желеобразная масса выходит из ядерной оболочки. Не используйте такие поврежденные ядра.

4. Извлеченное ядро освободите от приставшего к нему ци-топлазматического материала. Для этого его несколько раз всосите в кончик микропипетки с широким отверстием и выпустите обратно, прежде чем перенести в пробирку, стоящую во льду. При известном навыке очищенное ядро можно получить через 30 с после прокалывания ооцита. Энуклеированный ооцит используйте в дальнейших экспериментах, как описано в разд. 5 для интактных ооцитов.

6.1.2. Метод 2

1. Поместите ооцит в холодную 5—20%-ную ТХУ на 15 мин.

2. Вскройте каждый ооцит часовым пинцетом и извлеките фиксированное кислотой ядро.

3. Объедините требуемое число ядер и осадите их в микроцентрифуге в течение 30 с.

4. Отбросьте супернатант и отмойте ядра от оставшейся кислоты с помощью двух промывок ядерного осадка холодным ацетоном.

5. Белки осажденных ядер можно растворить прямо в буфере для нанесения (табл. 7) и анализировать с помощью электрофореза в ПААГ—ДСН.

6.2. Ингибирование трансляции

Циклогексимид, добавленный в среду инкубации в концентрации 100 мкг/мл, эффективно блокирует трансляцию. В присутствии этого соединения ооциты живут не более 36 ч [62].

6.3. Ингибирование посттрансляционной модификации

Исходный раствор туникамицина в концентрации 1 мг/мл готовят в диметилсульфоксиде и хранят при —20 °С. Лучше всего вводить препарат в концентрации 40 мкг/мл во время микроинъекции вместе с мРНК [39]. Кроме того, туникамицин вводят в инкубационную среду (2 мкг/мл). Прежде чем метить ооциты радиоактивным предшественником, проинкубируйте их 24 ч с антибиотиком. Если добавлять туникамицин только в инкубационную среду даже в концентрации 20 мкг/мл, его эффективность недостаточна. Рис. 11 иллюстрирует использование туникамицина.

Трансляция эукариотической мРНК в ооцитах Xenopus

359

Тритон ¦— + -Дорожка 1 2 3

Рис. 13. Эксперимент по защите от протеазы. мРНК из яйцеводов кур инъецировали в ооциты и метили белки в среде, содержащей [3?*S j-метионин. Фракцию мембраны выделяли из гомогенизированных ооцитов методом центрифугирования на сахарозную подушку (разд. 5.3.2) и •обрабатывали протеиназой К в присутствии или в отсутствие тритона Х-100, как указано в разд. 6.4. Обработанные образцы анализировали с помощью иммунопреципитации антителами против •овальбумина и электрофореза в 12,5%-ном ПААГ (разд. 5.4 и 5.5). Дорожка 1—мембраны инкубировали при 0 °С в отсутствие протеиназы К. Дорожки 2 и 3 — мембраны инкубировали в присутствии протеиназы К 90 мин при 20 °С. Обозначения: Ов — овальбумин.

Ов

6.4. Эксперименты по защите от протеаз

Часто оказывается необходимым определить расположение белков относительно мембран, с которыми они соосаждаются при центрифугировании. При фракционировании ткани белки часто беспорядочно налипают на мембранный дебрис. Однако такие белки доступны для экзогенных протеаз, поэтому устойчивость белков к протеолизу в отсутствие детергента с большой вероятностью указывает на то, что белки встроены в мембраны. Ниже приведена методика, которая с успехом используется на ооцитах (пример эксперимента, поставленного по этой методике, показан на рис. 13).

1. Получите препарат мембран ооцита с помощью центрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы (разд. 5.3.1).

2. Разведите препарат мембран 3 объемами Т-буфера {табл. 7) и разделите его на 3 пробы.

3. В первую пробу добавьте протеиназу К (Calbiochem) до конечной концентрации 100 мкг/мл. Во вторую пробу добавьте протеиназу К (100 мкг/мл) и тритон Х-100 (1%, по объему). Третья проба представляет собой контроль, и в нее ничего не добавляйте.

4. Проинкубируйте все пробы 90 мин при 20 °С.

360

Глава 10

5. Добавьте в конце инкубации PMSF до конечной концентрации 1 мМ и проанализируйте белковые продукты, как описано в разд. 5.4—5.7.

7. Использование системы ооцитов

Синтез белков в ооцитах Xenopus можно программировать с помощью эукариотических мРНК, выделенных из самых разнообразных организмов, от растений до млекопитающих. В большинстве случаев эти мРНК эффективно транслируются, если их качество соответствует требованиям, указанным в разд. 3.3.1. Однако, по всей вероятности, в ооцитах не идет трансляция прокариотических мРНК и мРНК, выделенных из органелл (например, из митохондрий) [10]. Кроме того, если мРНК кодируют такие белки, для которых в ооците нет соответствующего клеточного компартмента, то продукты трансляции могут оказаться весьма нестабильными и их не удастся выявить в цитоплазме. Например, нам не удалось обнаружить какие бы то ни было продукты трансляции после инъекции мРНК ядерного происхождения, кодирующей хлоропластные белки гороха; точно так же не удалось обнаружить малатдегидрогеназу клещевины— фермент, предназначенный для глиоксисом (этих растительных органелл в ооците нет). В то же время препарат мРНК из клещевины дает при трансляции лектин, который, как и следовало предполагать, переносится в эндоплазматический ретикулум ооцита. В бесклеточных системах трансляции этот препарат мРНК обеспечивает синтез обоих белков.

Основное преимущество системы ооцитов — ее способность правильно модифицировать многие белки после трансляции. Однако модификация некоторых белков происходит не совсем правильно [31, 37]. К счастью, в ряде случаев это не имеет значения, даже если планируется проводить биологические испытания продуктов. Так, показано, что цепи мышиных иммуноглобулинов неправильно гликозилируются в ооцитах (рис. 14), но тем не менее эти цепи собираются и образуют биологически активные антитела [50]. Еще один подобный пример известен из литературы [51].

Итак, ооцит — весьма эффективная система трансляции. Однако использование этой системы оправданно только в определенных обстоятельствах, когда ее преимущества перед бесклеточными системами трансляции имеют особое значение. Сюда можно отнести ситуации, когда единственный реальный метод детектирования — биологическое испытание продукта, а также когда количество мРНК очень мало. Наконец, ооцит представляет собой идеальную систему для исследования посттрансляционных событий, особенно теперь, когда стало возможным осу-

Трансляция эукариотической мРНК в ооцитах Xenopus

361

Эндо Н+- + - + - + -Дорожка 1 2 3 4 5 6 7 8

Клетки Ооциты миеломы

Рис. 14. Сравнение боковых олигосахаридных цепей, которые присоединяются к тяжелым цепям иммуноглобулинов в ооцитах и в клетках миеломы МОРС 21. Незадолго перед секрецией из клеток миеломы олигосахаридные боковые цепи тяжелых цепей иммуноглобулина переходят из «простой» в сложную форму. Только сложная форма устойчива к эндогликозидазе ? (эндо Н). Действие эндо ? на тяжелые цепи иммуноглобулина, выделенные из миеломных клеток (дорожки 1 и 2) или из инкубационной среды (дорожки 3 и 4), анализировали в 12,5%-ном ПААГ в восстанавливающих условиях. Секретированная тяжелая цепь устойчива к действию фермента. Та же самая тяжелая цепь, синтезированная в ооцитах после инъекции мРНК, наоборот, чувствительна к действию фермента, независимо от того, выделена она из клеток (дорожки 5 и 6) или секретирована в среду (дорожки 7 и 8)» Легкая цепь не гликозилируется ни в каких клетках.

362

Глава 10

ществить в ооцитах синтез мутантных белков после инъекции клонированных ДНК, подвергнутых генетическим манипуляциям [76] (см. также гл. 2).

Литература

1. Davidson ?. Gene Activity in Early Development (2nd Edn.), published by Academic Press Inc., New York and London, 1976.

2. Woodland H. Biosci. Rep., 2, 471 (1982).

3. Gurdon J. В., Melton D. A. Annu. Rev. Genet., 15, 189 (1981).

4. Harland R. M., Laskey R. A. Cell, 21, 761 (1980).

5. Laskey R. ?., Honda В. M., Mills A. D., Morris N. R., Wyllie A. H., MertzJ. E., De Robertis ?. ??., Gurdon J. B. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 18, 643 (1978).

6. Zehavi-Willner Т., Lane C. Cell, 11, 683 (1977).

7. Lane C. D., Knowland J. S. In: The Biochemistry of Animal Development, vol. 3, Weber R. A. (ed.), Academic Press Inc., New York and London, ? 145, 1975.

8. Asselbergs F. M. Mol. Biol. Rep., 5, 199 (1979).

9. Marbaix G., Huez G. In: The Transfer of Cell Constituents into Eukaryotic Cells, vol. 31, Celis J. E., Graessmann A. and Loyter A. (eds.), NATO Advanced Study Seriea A, Plenum Press, New York and London, p. 347 1980

10. Lane C. D. Curr. Top. Dev. Biol., 18, 89 (1983).

11. Gurdon J. В., Lane C. D., Woodland H. R., Marbaix G. Nature, 233, 177 (1971).

12. De Robertis ?. M., Partington G. ?., Longthorne R. F., Gurdon J. В J Em-bryol. Exp. Morphol., 40, 199 (1971).

13. Rutgers Т., Neeleman L., Van Vloten-Doting L., Cleuter Y., Hubert E, Huez G., Marbaix G. Arch. Int. Physiol. Biochem., 84, 654 (1976).

14. Satden M.,

страница 80
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.03.2019)