активность HSV-кодируемой тимидинкиназы (рис. 7). Еще одним тестом на специфичность фермента может служить реакция с антисывороткой к тимидин-киназе HSV. Альтернативный способ выявления активного ^-гена HSV состоит в применении теста на присутствие ife-мРНК 3*

36

Глава I

Таблица 13. Выделение суммарной клеточной РНК1

1. Приготовьте следующие растворы: Гуанидинийхлорид

Приготовление раствора описано в табл. 3 Раствор CsCl (5,7 ? CsCl, 50 мМ ЭДТА) CsCl (BRL, Ultrapure reagent) 47,98 г

ЭДТА-Nas 0,93 г

Дистиллированная вода до конечного объема 50 мл

Если необходимо, доведите показатель преломления раствора до 1,3995

добавлением сухого CsCl или дистиллированной воды. 10XMOPS (0,2 ? MOPS, 50 мМ ацетат натрия, 10 мМ ЭДТА, ? ? 7,0)

MOPS (натриевая соль) 20,93 г

Ацетат натрия-ЗН20 3,40 г

ЭДТА-Ыа2 1,86 г

Дистиллированная вода до конечного объема 500 мл.

Доведите рН до 7,0 уксусной кислотой. Раствор LiCl — мочевина (4,0 ? LiCl, 8,0 ?. мочевина)

LiCl (BDH) 8,48 г

Мочевина (Sequanal grade, Pierce Chemical Co.) 24,00 г

Дистиллированная вода до конечного объема 50 мл.

2. Ресуспендируйте 1—2-Ю8 клеток в 5 мл раствора гуанидинийхлорида и разрушьте их гомогенизацией в соответствии с табл. 3., п. 4.

3. Добавьте 0,5 мл 20%-го ДСН (особой чистоты, BDH) и прогрейте при. 65 °С 1—3 мин.

4. Наслоите эту смесь поверх 3 мл подушки из раствора CsCl и отцентрифугируйте 48 ч при 140 000g, 15 °С, например, в угловом титановом роторе при 40 000 об/мин в 10 пробирках по 10 мл.

5. После центрифугирования удалите белок, собравшийся наверху, и выбросьте его. Отберите ДНК, расположенную полосой посредине пробирки, поскольку ее можно осадить изопроланолом и очистить для дальнейшего использования согласно табл. 3. РНК осаждается на дно пробирки.

6. Слейте из пробирки всю жидкость и растворите РНК в 0,7 мл дистиллированной воды.

7. Перенесите этот раствор РНК в пробирку от микроцентрифуги и сразу добавьте 0,7 мл раствора LiCl — мочевина.

8 Перемешайте раствор и оставьте его на ночь при 4°С для осаждения

9 Отцентрифугируйте раствор 10 мин на микроцентрифуге для осаждения ' РНК.

10 Растворите РНК в 1,0 мл 0,lxMOPS и затем отдиализуите этот раствор в течение 2 ч против 0.1XMOPS. Выход РНК должен составлять ~ 1 мг РНК на 1-Ю8 клеток2.

¦ Вся используемая стеклянная или пластиковая посуда должна быть обработана О 0Э%-ным раствором диэтилпнрокарбоната в воде с последующим прогреванием при 120 °С в течение 2 ч для удаления следов РНКазы. Все растворы, в которых будет находиться РНК должны быть по возможности проавтоклавированы перед использованием Чтобы предотвратить загрязнение препаратов РНКазой (см. гл. 8), эксперимента-тоо должен работать в пластиковых перчатках одноразового использования.

' РНК можно хранить длительное время при —20 °С в осажденном виде в этаноле или в высушенном состоянии после лиофилизации.

HSV [10, 43]. В табл. 13 описано выделение суммарной клеточной РНК, а в табл. 14 —тест на наличие /6-мРНК методом гибридизации.

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

37

Таблица 14. Спот-гибридизационный тест на наличие тимидинкиназной мРНК [43]

1. Приготовьте следующие растворы: Буфер для предгибридизации

50%-ный раствор деионизованного формамида1 5XSSC2

бХраствор Денхардта3

Денатурированная ДНК спермы лосося в концентрации 250 мкг/мл4 50 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 6,5 Буфер для гибридизации 50%-ный раствор формамида в деионизованной воде 5XSSC

1Храетвор Денхардта

Денатурированная ДНК спермы лосося в концентрации 100 мкг/мл 10%-ный раствор декстрансульфата натрия 500 (Sigma) 20 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 6,5

2. Растворите суммарную клеточную РНК, выделенную так, как это описано в табл. 13, в дистиллированной воде до концентрации 4 мг/мл.

3. Предварительно обработайте нитроцеллюлозный фильтр (10x10 см), смачивая его водой и затем ополаскивая в 20XSSC в течение нескольких минут или выдерживая его в этом растворе до тех пор, пока он не понадобится. Промокните фильтр, высушите на воздухе и затем нанесите пробы РНК по 5 мкл на отмеченные участки фильтра.

4. Прогрейте фильтр при 80 °С 2—3 ч.

5. Перенесите фильтр в пластиковый пакет и добавьте 10 мл предгибриди-зационного буфера. По возможности удалите из пакета воздух и запаяйте его с помощью специального приспособления. Проинкубируйте пакет в водяной бане при 42 °С 3—5 ч.

6. Выньте пакет из водяной бани и вскройте его, отрезав один угол ножницами. Выдавите из пакета как можно больше предгибридизационного буфера.

7. Добавьте 5—10 мл гибридизационного буфера, содержащего денатурированную ДНК-зонд в концентрации 5—10 нг/мл, заранее помеченную in vitro с помощью 32Р методом ник-трансляции. Удалите из пакета воздух и вновь запаяйте отрезанный край. Проинкубируйте пакет в водяной бане при 42 °С 12—15 ч.

8. Выньте пакет из водяной бани и отрежьте его края с трех сторон. Надев пластиковые перчатки одноразового использования, достаньте фильтр и сразу же погрузите его в пластиковую ванночку с 250 мл 0,5°/о-ного ДСН в 2XSSC при комнатной температуре.

9. Осторожно потряхивайте ванночку при комнатной температуре в течение 15 мин.

10. Слейте жидкость и вновь промойте фильтр при комнатной температуре в свежем 0,5%-ном ДСН в 2XSSC, следуя пп. 8 и 9.

11. Добавьте 250 мл свежего 0,5%-ного ДСН в 2XSSC и проинкубируйте при 60 °С 30 мин на водяной бане со встряхиванием.

12. Замените раствор для промывания на 250 мл 0,5%-ного ДСН в 0.1XSSC и проинкубируйте при 60 °С 30 мин на водяной бане со встряхиванием.

13. Повторите л. 11.

14. Высушите фильтр на листе бумаги Whatman ЗММ.

15. Перенесите фильтр в пластиковый мешочек и проведите радиоавтографию.

1 Дейонизуйте формамид путем встряхивания 5 г смешанной ионнообменной смолы (например, Amberlite МВ-3 нли Dowex MR-3 фирмы Sigma) со 100 мл формамида в течение 30 мин при комнатной температуре в вытяжном шкафу. Профильтруйте формамид через хроматографическую бумагу Whatman ЗММ и до использвания храните при —20 °С.

38

Глава 1

2 !XSSC=0,15 ? Nad, 15 мМ цитрат натрия (трехзамещеиный).

3 Концентрированный 50-кратиый раствор Денхардта готовят путем растворения 1 г фиколла (мол. масса 400 000), 1 г поливинилпирролидона и 1 г БСА (фракция V) в

1u0 "лч^'цы Приготовить денатурированную ДНК спермы лосося, растворите ДНК (фирмы Sigma тип III, натриевая соль) в воде до концентрации 10 мг/мл. Раздробите ДНК, пропустив ее 10 раз через иглу для инъекций № 19. Прокипятите раствор ДНК 10 мин, быстро охладите и затем храните при —20 °С.

3.1.2. Гипоксантин-гуанин — фосфорибозилтрансфераза (HGPRT)

Гипоксантин-гуанин—фосфорибозилтрансфераза (HGPRT) — фермент, катализирующий дополнительные пути метаболизма аденина и гуанина. Можно получить HGPRT^-клетки, а затем отобрать HGPRT+-peBepTaHTbi и трансформанты на среде HAT точно таким же образом, как ТК+-клетки ([40, 41]; табл. 1).

3.1.3. Аминогликозид — фосфотрансфераза (???)

В одной из удобных доминантных селективных систем для клеток млекопитающих используется прокариотический ген аминогликозид-З'-фосфотрансферазы (aph). Транспозон Тп601 (903) содержит ген aph-l, а транспозон Тп5 — ген aph-ll. Эти гены обусловливают устойчивость к аминогликозидным антибиотикам канамицину, неомицину и З'-дезоксистрептамину (известному также как генетицин или G418), ингибирующим синтез белка у прокариот. ??? инактивирует их путем фосфорилирования аминогликозидного остатка. Указанные антибиотики ингибируют также синтез белка в эукариотических клетках и, таким образом, позволяют создать доминантную селективную систему, для которой не требуются специальные мутанты.

Клетки млекопитающих не содержат эндогенных аминогли-козид-фосфотрансфераз, но бактериальные ферменты могут синтезироваться в клетках млекопитающих, если к соответствующим генам присоединить регуляторные последовательности эукариотического происхождения [44]. Ген Tn5 aph-ll был соединен с регуляторными последовательностями гена tk HSV; структура соответствующего гибридного гена показана на рис. 8, А. Ген aph-U был включен в векторы на основе вируса SV40 и использован для изучения экспрессии гена интерферона [45].

Генетицин (G418) можно использовать для отбора клеток, в которых происходит экспрессия бактериальных генов aph-l и aph-ll; этот антибиотик имеется в продаже (Gibco). Клетки, в которых происходит экспрессия гена aph, можно отобрать на ростовой среде, в которую добавлен генетицин в концентрации 100—500 мкг/мл, убивающий нормальные АРН~-клетки. Клетки разных культур обладают неодинаковой чувствительностью к

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

39

Рис. 8. Структура плазмидных векторов, содержащих биохимически селектируемые маркеры. А. Плазмида pAG60 содержит ген аминогликозид-З'-фосфо-трансферазы (aph) [44]. Б. Плазмида pSV2-cat содержит ген хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (cat) [47]. В. Плазмида pSV2-gpi содержит ген ксантин-гуанин — фосфорибозилтрансферазы (gpt) [49]. Г. Плазмида pSV2-dA/r содержит ген дигидрофолатредуктазы [51]. Пунктирными линиями обозначены плазмидные последовательности; жирными полосками — последовательности aph, cat, gpt и dhfr, заштрихованными — регуляторные последовательности гена tk HSV-1 в pAG60, последовательности SV40 в pSV2-ca/, в pSV2-g-p/ и в pSV2-utt/r; стрелками указано направление транскрипции. Карты изображены без соблюдения масштаба. ? — EcoRl, В — ВатШ, Pv — PvuU, Sm — Smal, Bg — Bglll, ? — Hindlll, ori — место начала репликации, Amp — ген

?-лактамазы.

генетицину, поэтому наиболее подходящую концентрацию антибиотика нужно определять эмпирически (D. A. Spandidos, S. Campo, неопубликованные данные).

3.1.4. Хлорамфеникол-ацетилтрансфераза (CAT)

Транспозон Тп9 кодирует хлорамфеникол-ацетилтрансфера-зу (CAT)—фермент, который инактивирует хлорамфеникол, ацетилируя его. В эукариотических клетках этот фермент не синтезируется. Однако ген cat может быть экспрессирован при участии эукариотических промоторов, и существует чувствительный ферментативный тест на его наличие [46, 47]. Более того, бы