альную (Colman, Drummond, неопубликованные наблюдения).

Рис. 9. А. Ооцит во время микроинъекции. Б. Нормальные ооциты В Не полноценные ооциты. Обратите внимание на неравномерную пигментацию последних по сравнению с более или менее равномерно окрашенными нормальными ооцитами.

346

Глава 10

4. Культивирование ооцитов после инъекции и введение в них радиоактивной метки

4.1. Среда для культивирования

Чаще всего для культивирования ооцитов используют модифицированную солевую среду Барта, содержащую в качестве буфера трис или HEPES (табл. 5). При физиологических значениях рН HEPES имеет лучшую буферную емкость, но это не так важно, потому что ооциты выдерживают значительные колебания рН (рН 7,5±0,4). В солевой раствор следует добавить пенициллин и стрептомицин, а при исследованиях секреции белка рекомендуется вводить также гентамицин и фунгицид нистатин. Кроме того, добавление в среду сыворотки плода коровы до концентрации 5% или лошадиной сыворотки (в обоих случаях диализованной против солевого раствора Барта) предотвращает восстановление сульфгидрильных связей в продуктах секреции [49]. При этом подавляется также протеолитическое расщепление секретируемых белков протеазами, которые выделяются клетками фолликулярного слоя, окружающими ооциты [71]. Сыворотку необходимо добавлять в среду только в случае секретируемых белков.

4.2. Выбор радиоактивных аминокислот

Поскольку ооциты проницаемы для аминокислот, белки ооцита включают радиоактивные аминокислоты, если их просто добавить в среду. Однако поглощение экзогенных радиоактивных аминокислот из среды и их уравновешивание с внутренним пулом занимают 30—60 мин. Поэтому при необходимости кратковременного импульсного введения метки в белок следует инъецировать концентрированный раствор меченой аминокислоты [72]. Даже после этого диффузия внутри ооцита занимает некоторое время. Если при этом вводят аминокислоту, эндогенный пул которой невелик, радиоактивная аминокислота может быть израсходована еще до того, как ее концентрация уравновесится по всему ооциту.

Выбор меченой аминокислоты зависит от потребностей данного эксперимента. Чаще всего используют [355]-метионин, так как он сравнительно недорог, имеет высокую удельную активность и для 35S характерно ?-излучение с высокой энергией (по сравнению с тритием). Эффективность избранной аминокислоты для мечения новосинтезированных белков ооцита сильно зависит от размера аминокислотного пула. В табл. 6 приведены размеры пулов различных аминокислот в ооците Xenopus. Пулы гистидина, пролина, лейцина и метионина сравнительно неве-

Трансляция эукариотической мРНК в ооцитах Xenopus

347

Таблица 6. Пулы аминокислот в крупных ооцитах Xenopus1

Аминокислота пмоль/ооцит

партия 1 партия 2

Лизин 182 158

Гистидин 67 84

Аргинин 96 95

Аспарагиновая кислота 265 470

Треонин 283 240

Серин 374 495

Глутаминовая кислота 857 741

Пролин2 67 78

Глицин 194 261

Аланин 273 153

Цистеин 36 _

Валин 84 125

Метионин2 29 31

Изолейцин 37 56

Лейцин2 45 84

Тирозин 73 32

Фенилаланин 54 45

1 Таблица составлена по неопубликованным данным, любезно предоставленным д-рами Вудлэндом и Адамсоном.

2 Судя по эффективности мечения белков в присутствии меченых метионина, лейцина и пролина, полный пул каждой из этих аминокислот, по-видимому, доступен для синтеза белка.

лики, поэтому часто используют именно эти радиоактивные аминокислоты. Однако в определенных условиях использование меченых аминокислот, пул которых в ооците достаточно велик, может давать преимущества. Например, для мечения гистонов используют [3Н]-лизин [73], так как он преобладает в этих белках.

Ооциты выдерживают очень высокие концентрации радиоактивной аминокислоты, и обычно в инкубационную среду добавляют 0,1—5 мКи/мл. Если инкубировать 5 ооцитов в 30 мкл среды, содержащей 1 мКи/мл [35S]-метионина с удельной активностью 350 Ки/ммоль, в течение 10 ч, то включение в белок в одном ооците достигает 2-I06 расп./мин. Если даже считать, что лишь 10% новосинтезированного белка кодируется инъецированной мРНК, то очевидно, что для анализа потребуется весьма небольшая часть всего материала. Следует, правда, отметить, что при небольшом пуле аминокислоты и ее высокой удельной активности новосинтезированные белки обладают высокой, но постоянно изменяющейся удельной активностью. Поэтому, если нужны количественные данные, эксперименты следует планировать с большой тщательностью. Например, чтобы получить линейную зависимость включения [3SS]-метионина в белок от времени в течение 24 ч (в приведенных выше услови-

348

Глава 10

ях), удельную активность аминокислоты следует понизить до 50 Ки/ммоль, добавив в среду немеченый метионин до конечной концентрации 0,06 мМ.

Если в эксперименте требуется провести разведение нерадиоактивной средой, то по нашему опыту при временах инкубации, не превышающих 1 ч, вполне достаточно ввести немеченую аминокислоту в концентрации 10 мМ (в случае метионина). При высокой удельной активности [355]-метионина (более 350 Ки/ммоль) при инкубации дольше 6 ч разведение метки происходит и без вмешательства экспериментатора. Поэтому если существует возможность синтеза какого-либо нестабильного белкового продукта, то проводить более длительную инкубацию не рекомендуется.

4.3. Другие радиоактивные предшественники

В некоторых экспериментах используют другие радиоактивные предшественники помимо меченых аминокислот.

[3Н]-ацетат добавляют в среду в концентрации 10—100 мКи/мл для доказательства посттрансляционного ацетилирования белков. Правда, некоторая часть [3Н]-ацетата превращается в ходе метаболических процессов в [3Н]-аминокислоты [72], поэтому новосинтезированные белки, как правило, также метятся.

[г2Р]-фосфат используют в концентрации 10—20 мКи/мл для доказательства фосфорилирования белков. Однако даже при такой концентрации изотопа включение очень низкое [73], так как в ооците имеется большой пул неорганического фосфата.

[3Я]- или [нС\-манноза. [14С]-маннозу в концентрации 10 мкКи/мл [47] или [3Н]-маннозу [45] в концентрации 1 мКи/мл добавляют в среду для доказательства гликозилиро-вания.

4.4. Выбор времени мечения

Прежде чем трансляция мРНК, инъецированных в ооциты, достигнет максимального уровня, может пройти несколько часов [61]. Для решения многих задач этот период «вовлечения» мРНК в трансляцию можно не принимать во внимание и начинать инкубацию вскоре после инъекции. Именно таким образом следует проводить эксперименты при использовании для инъекций ро1у(А)_-мРНК, так как некоторые из них [33], хотя и не все [27], нестабильны в ооцитах. Ро1у(А)+-мРНК, наоборот, весьма стабильны в ооцитах [9] (с известными оговорками — см. разд. 3.3.1). При исследовании секреции перед мечением ооциты после инъекции следует оставлять на ночь. При этом выявляются неполноценные ооциты, которые удаляют перед

Трансляция эукариотической мРНК в ооцитах Xenopus

349

мечением (рис. 9, В), что позволяет более экономно расходовать меченый предшественник и свести к минимуму неспецифическую утечку белков ооцитов в культуральную среду. Такая утечка может осложнить последующий анализ и обеспечить питательный субстрат для роста в среде микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам.

4.5. Процедура мечения ооцитов

Как описано в разд. 4.2, ооциты можно пометить, инкубируя их в среде в присутствии радиоактивного предшественника или вводя в них изотоп. Здесь мы рассмотрим первый метод; инъекцию изотопа проводят, как описано ранее в этой главе для мРНК (разд. 3.3).

Пометьте ооциты в ячейках панелей для микротитрования одноразового пользования. Инкубируйте ооциты по пять штук в ячейке в 30 мкл среды, проследив, чтобы все ооциты были погружены в среду. При изучении секреции покройте предварительно поверхность ячейки слоем белка. Для этого внесите в них раствор бычьего сывороточного альбумина (0,5 мг/мл в солевом растворе) на 20 мин при 37 °С и промойте солевым раствором.

Если пробы ставят с целью последующего определения синтезированного белка, можно использовать большие объемы инкубационной среды. Для этого идеально подходят пластиковые прокладки в крышках для сцинтилляционных кювет (годятся прокладки практически любой формы). В каждой из них можно инкубировать примерно 25 ооцитов в 300 мкл среды.

5. Сбор, фракционирование и анализ ооцитов и инкубационной среды после культивирования

Как отмечено во введении, в ооцитах Xenopus происходит не только трансляция и модификация чужеродных белков, но и их перенос в соответствующее место в клетке, а также экспорт секретируемых белков. Выбор способа фракционирования зависит от цели эксперимента. Если гомогенизируют ооциты в присутствии детергентов, то солюбилизируются все связанные с мембранами белки, тогда как гомогенизация в отсутствие детергента и последующее фракционирование в градиенте сахарозы позволяют получить предварительные данные о внутриклеточной локализации того или иного белка. В некоторых случаях, например при синтезе интерферонов млекопитающих, экспорт белка происходит так быстро, что для оценки синтеза белка достаточно проанализировать только инкубационную среду

350

Глава 10

Кроме того, выбор метода анализа зависит от особенностей того или иного исследуемого белка, а также от того, что в отличие от некоторых бесклеточных систем в ооците имеется высокий уровень эндогенной трансляции. Во многих случаях, особенно если концентрация специфической мРНК низка, необходимо прибегать к таким методам анализа, как иммунопреци-питация, двумерный гель-электрофорез, избирательная экстракция или подходящий биологический тест. Ниже будут описаны лишь наиболее распространенные методы фракционирования и анализа.

5.1. Разделение ооцитов и инкубационной среды после инкубации

По окончании инкубации внимательно осмотрите ячейки панели для микротитрования. Отберите среду только из тех ячеек,, где нет неполноценных ооцитов (рис. 9). Извлеките ооциты и промойте их модифицированной солевой средой Барта. Если оо