циты не так сильно подсыхают за время инъекции.

«11,1!,, Д изготовления микропипеток. А. Самодельный прибор для вытягивания микропипеток, состоящий из вольфрамовой нагревательной спи рали (/), зажима для пипеток (2), штатива, обеспечивающего перемещение нагревательной спирали в двух направлениях (3), груза для пийетоТ (4) запасных нагревательных спиралей (5) и реостата-регулятора (6) Б Микрокузница. В этом приборе использованы два трехмерных манипулятора один из них удерживает стеклянную микропипетку (7)/ а другой - плэтиновую нагревательную спираль (8). Эти манипуляторы продает фирма Research P™en//S^Ltd- СтеРеомикР°<к°л (9) показан Рв горизонтальном положении Реостат (W), позволяющий менять сопротивление ступенчато через 1 Ом входит в состав самодельного источника питания. Микрокузницу, включающую все перечисленные компоненты, можно купить у той же фирмы

22»

340

Глава 10

3.1.5. Прибор для изготовления микропилеток

Для изготовления микропипеток нужен надежный прибор для оттягивания кончиков. Он состоит из вольфрамовой нагревательной спирали и стабилизирующего регулируемого источника питания. Можно использовать самодельный прибор (рис. 4, Л) или имеющийся в продаже надежный прибор для оттягивания микроэлектродов (фирма Searle Bioscience). Микрокузница для заострения кончиков микропипеток при инъекциях мРНК в ооциты не нужна. Однако она необходима, если проводят инъекции в оплодотворенные яйца или ядра ооцитов (гл. 2). Подходящий прибор (рис. 4,5) можно купить у фирмы Research Instruments Ltd.

3.1.6. Вспомогательное оборудование

Ооциты Xenopus лучше всего культивировать примерно при 20 °С. При 25 °С синтез белка идет более интенсивно, но ооциты живут не так долго. При температуре выше 30 °С в ооцитах синтезируется только один основной белок теплового шока с мол. массой 72 кДа [67] и инъецированные мРНК не транслируются (A. Colman, неопубликованные данные). Чтобы поддерживать постоянную температуру 20 °С, желательно, хотя и не обязательно, иметь инкубационную камеру с охлаждением или обычный инкубатор в холодной комнате.

3.2. Изготовление, калибровка и хранение микропипеток

По нашему опыту изготовление и калибровка микропипеток— наиболее узкое место при микроинъекциях ооцитов. Внешний диаметр кончика микропипетки не должен превышать 30 мкм. Значительный участок основной трубки с внешним диаметром около 300 мкм должен во время инъекции находиться в поле зрения, чтобы можно было визуально контролировать процесс поочередного введения раствора в несколько ооцитов. К тому же этот основной участок трубки должен иметь ровные, параллельные стенки на протяжении не менее 15 мм, чтобы его было легко откалибровать.

3.2.1. Изготовление

На рис. 5 схематически показаны отдельные этапы изготовления микропипеток. Для этого используют капилляры из твердого стекла (например, фирмы BDH Chemicals Ltd.).

1. Оттяните вручную каждый капилляр в пламени бунзенов-ской микрогорелки, чтобы внешний диаметр составлял примерно 200 мкм (рис. 5,А). Для воспроизводимого и быстрого изготовления микропипеток самое главное — научиться оттягивать вручную такие стандартные капилляры.

Трансляция эукариотической мРНК в ооцитах Xenopus

341

, Диаметр 1 мм

Внешний диаметр - 200 мкм

"Оттянуть— вручную

> Нагревательная < спираль

Груз

Косой скол капилляра^

2*

Внешний

диаметр ~ 200 мкм

Внешний диаметр 25 мкм ~

Нагревательный элемент микрокузницы

Обломайте тонкий' кончик стеклянной пипетки наискось часовым пинцетом

с некоторыми изменениями из [68].

2. Поместите капилляр в прибор для оттягивания капилляров так, чтобы вольфрамовая спираль окружала часть оттянутого участка (рис. 5, Б). Прикрепите подходящий груз к концу капилляра.

3. Подайте напряжение на спираль. Когда стекло разогреется, груз оттянет капилляр вниз и образуется более узкий участок в середине.

4. Сломайте его среднюю часть часовым пинцетом так, чтобы получить микропипетку с косым сколом на конце и с размерами, указанными на рис. 5, Б. Окончательный диаметр кончика микропипетки зависит от размера нагревательной спирали, силы тока, величины подвешенного груза и т. д. Эти условия следует подобрать эмпирически.

5. Если нужно, кончик микропипетки можно сделать гладким и острым, на мгновение прикоснувшись им к нагревательному элементу микрокузницы (рис. 5, В).

3.2.2. Калибровка

После проникновения микропипетки в ооцит введение образца с помощью гидравлической системы контролируют по положению мениска в просвете микропипетки. Обычно инъецируют

342

Глава 10

Рис. 6. Калибровка микропипеток. Схематически показаны наполнение микропипетки (А) и выпускание капельки жидкости для калибровки (Б); подробнее см. в тексте. В. На калибровочной кривой отложена зависимость объема (4/зЯГ3) от диаметра (2г) сферы, где г —радиус.

50 нл. Ниже описана процедура калибровки пипетки, которая служит исключительно для тренировки. После 2—3 сеансов микроинъекций она быстро становится ненужной: исследователь может вводить 50 ±20 нл, не нуждаясь в предварительной калибровке и даже нанесении рисок на пипетку.

Калибровка микропипетки включает следующие этапы.

1. Нанесите несколько рисок на равном расстоянии друг от друга подальше от кончика пипетки, как показано на рис. 6, Л.

2. Наполните пипетку вазелиновым маслом, а затем водой, остановив пузырек воздуха между жидкостями.

3. Медленно выпустите воду, чтобы образовалась круглая капля на кончике пипетки, а мениск передвинулся на расстояние между двумя рисками (рис. 6,5).

4. Измерьте диаметр капли с помощью окулярного микрометра, вычислите ее объем и нанесите результат на рассчитанную калибровочную кривую (рис. 6,?).

3.2.3. Хранение микропипеток

Храните микропипетки по одной в вертикальном положении острием вверх в длинных (длиной более 10 см) тонких пробирках. Поместите пробирки вертикально в химический стакан и накройте фольгой. Перед инъекциями мРНК стерилизуйте пробирки нагреванием (не менее 1 ч при 200 °С).

Трансляция эукариотической мРНК в ооцитах Xenopus

343

Рис. 7. Зависимость интенсивности синтеза белка от количества мРНК, инъецированной в ооциты Xenopus. Данные представляют собой относительное включение [3Н]-лейцина в не-секретируемый белок — кроличий глобин (крестики) и в группу секрети-руемых белков — зеинов (кружки) в ооците после инъекции указанного количества мРНК. Включение метки выражено в процентах от максимального включения при инъекции глобиновой мРНК, принятого за 100%. (График построен по опубликованным данным [69].)

Рис. 8. Деградация мРНК в ооцитах. Стабильность инъецированных глобиновой (крестики) и зеиновой (кружки) мРНК в ооцитах через 10 ч после инъекции анализировали с помощью гибридизации. (График построен по опубликованным данным [69].)

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Количество инъецированной мРНК, нг/ооцит

2 -

I-1-1_?_' ?

0 20 40 60 80 100 Инъецированная мРНК, нг/ооцит

3.3. Микроинъекции матричной РНК

3.3.1. Подбор концентрации мРНК

Растворите мРНК в дистиллированной воде и храните маленькими аликвотами (около 5 мкл) при — 70 °С. Лучше использовать очищенную мРНК [например, после хроматографии на oligo (dT)-целлюлозе], а не суммарную клеточную РНК, так как при этом количество белка, синтезированного в расчете на 1 нг инъецированной РНК, будет выше. Вместе с тем присутствие рРНК в образце не мешает трансляции. Как показано на рис. 7, в случае мРНК, кодирующих несекретируемые белки, количество синтезированного белка растет с увеличением количества инъецированной мРНК по крайней мере до 100 нг на ооцит (т. е. до введения 50 нл с концентрацией 2 мг/мл). Однако при высокой концентрации инъецированной мРНК происходит ее значительная деградация (рис. 8), поэтому синтез белка увеличивается нелинейно: удвоение количества мРНК не дает пропорционального увеличения синтеза белка. Если инъецируют мРНК, кодирующие секретируемые белки, то при высокой концентрации они также деградируют, причем насыщение аппарата трансляции достигается уже при инъекции 20 нг мРНК

344

Глава 10

(рис. 7). Из всех этих данных можно сделать вывод [69], что лучше всего инъецировать до 10 нг мРНК в один ооцит при концентрации мРНК 0,2 мг/мл, за исключением тех случаев, когда белок трудно выявить.

3.3.2. Заполнение микропипеток раствором матричной РНК

Перенесите небольшой объем раствора мРНК (1—2 мкл) на кусочек парафильма или нескофильма и наполните пипетку, всасывая мРНК. до того момента, пока мениск не дойдет до края поля зрения. Хотя это можно сделать, сохраняя пузырек воздуха между раствором и вазелиновым маслом (рис. 6), легче контролировать процесс, если вся микропипетка до забора пробы была заполнена маслом. Вазелиновое масло не оказывает никакого действия на мРНК, но граница масла и водного раствора плохо видна. Чтобы лучше ее видеть, можно ввести в вазелиновое масло жирорастворимый краситель быстрый красный. После заполнения микропипетки храните неиспользованный раствор мРНК на подложке на льду.

3.3.3. Микроинъекция

1. Перенесите 4—5 ооцитов (или 9—10, если вы достаточно опытны) на чистое предметное стекло с помощью пастеровской пипетки большого диаметра.

2. Отсосите избыток жидкости и поместите стекло на столик стереомикроскопа.

3. Способы иммобилизации ооцитов во время инъекции могут быть различными. Либо осторожно держите ооцит часовым пинцетом, либо расположите ооциты вдоль края второго предметного стекла, положенного поверх первого.

4. Введите 50 нл (±20 нл) РНК в вегетативную (желтую) область ооцита (рис. 9,А); при инъекции в анимальную (пигментированную) область старайтесь не повредить ядро ооцита, чтобы процент гибели ооцитов1' был не слишком высоким. Не давайте ооцитам подсыхать во время инъекции.

5. После инъекции перенесите ооциты обратно в солевой раствор Барта.

Позднее возможны повторные инъекции мРНК в те же ооциты [69, 70]. Имея опыт, можно инъецировать 200—300 ооцитов в час.

]) Равномерное распределение мРНК по ооциту происходит гораздо быстрее, если производить инъекцию в вегетативную или экваториальную область, а не в аним