Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

ния или еще чаще, если вода темнеет. Фирма Xenopus Ltd. продает корм строго определенного состава («гранулы для лягушек», «frog pellets»), но переход лягушек на этот корм занимает очень много времени, лучше всего приучать к нему на протяжении всего роста. Такой режим кормления не всегда возможен, если имеют дело с «дикими» лягушками. Подробнее с разведением и содержанием Xenopus можно ознакомиться в статье Гёрдона и Вудлэнда [64].

2.2. Извлечение ткани яичника из Xenopus

Зрелая самка Xenopus имеет около 30 000 крупных ооцитов диаметром более 1 мм. Поскольку обычно для эксперимента требуется не более 500—1000 ооцитов, было бы слишком расто-

Трансляция эукариотической мРНК в ооцитах Xenopus

333

чительным убивать лягушку ради одного эксперимента. Более того, в некоторых случаях оказалось крайне желательным время от времени повторно использовать одну и ту же самку, поскольку содержание некоторых компонентов в ооците варьирует у разных лягушек [65]. Однако если планируется провести несколько экспериментов или необходимы другие ткани данной лягушки, ее придется забить.

2.2.1. Ограниченное изъятие ооцитов под наркозом

1. Анестезируйте крупную самку Xenopus, погрузив ее на-15—30 мин в 0,1%-ный раствор этил-ж-аминобензоата (он также называется трикаин, или MS 222) в воде. Во время этой процедуры наденьте перчатки, так как это соединение — потенциальный канцероген.

2. После того как лягушка заснула, поместите ее на плоскую» поверхность и сделайте небольшой надрез (длиной около 1 см), с брюшной стороны через свободно прилегающую кожу и стенку брюшной полости в задней части тела, как показано на рис. 1.. В результате этой операции открывается доступ к яичнику, расположенному в брюшной полости и состоящему из 16 долей.

3. С помощью обычного пинцета вытяните одну долю яичника и наложите у ее основания лигатуру.

Рис. 1. Извлечение ооцитов из лягушек Xenopus. На схемах показано извлечение одной доли яичника через прорезь в стенке брюшной полости наркотизированного животного (А), а также инъекция барбитурата для усыпления.: лягушки и извлечение целого яичника (Б). Подробнее эти методы описаны в тексте. (Рисунки выполнены д-ром Дж. Брауном.)

334

Глава 10

4. Отрежьте долю ножницами и перенесите ее в модифицированный солевой раствор Барта (его состав и приготовление •описаны в табл. 5).

5. Наложите швы на стенку брюшной полости и на кожу по •отдельности.

6. Оставьте лягушку приходить в нормальное состояние на 24 ч в наклонном резервуаре, частично заполненном водой. В воду добавьте 0,5% NaCl и голову лягушки приподнимите над водой, чтобы она не утонула.

2.2.2. Изъятие целого яичника

1. Наркотизируйте лягушку инъекцией подходящего препарата концентрированного барбитурата (например, препарата Euthetal фирмы May and Baker). Для этого крепко зажмите задние лапки лягушки с помощью полотенца или марли, чтобы она не вырвалась, и инъецируйте 0,3 мл барбитурата на 100 г веса тела подкожно в нижнюю часть спины непосредственно над лапками (рис. 1,5).

2. Поместите лягушку в мелкий сосуд с водой, пока она не заснет.

3. Извлеките весь яичник через разрез, сделанный так, как описано в разд. 2.2.1. Если разрез будет больше, это может привести к повреждению крупных кровеносных сосудов брюшной полости, что затруднит операцию.

2.3. Подготовка ооцитов к инъекции

Чтобы ооциты Xenopus сохранили жизнеспособность достаточно долго, совершенно необходимо тщательно промыть их в модифицированном солевом растворе Барта (табл. 3) сразу после извлечения из лягушки. С помощью часового пинцета разделите долю или доли яичника на небольшие кусочки примерно по 10—30 крупных ооцитов. В этих кусочках будут и небольшие незрелые ооциты (рис. 2), но микроинъекцию удобно делать только в крупные ооциты. Храните эти кусочки в чашках Петри при плотности примерно 30 кусочков на 20 мл раствора Барта. Для длительного хранения (несколько дней) поместите их в охлаждаемый инкубатор (например, фирмы Gallen-kamp) при 18—21 °С. Более мелкие кусочки (около 10 ооцитов) можно использовать непосредственно для инъекций. Хотя для выделения отдельного ооцита необходимы дополнительные манипуляции, в процессе которых можно внести новые повреждения, это делают довольно часто, так как с изолированным ооцитом работать удобнее, особенно при проведении инъекций ш ядро ооцита (гл. 2). Кроме того, в составе кусочков остается

Трансляция эукариотической мРНК в ооцитах Xenopus

335

Таблица 5. Состав и приготовление модифицированного солевого раствора Барта

Состав1

88,0 мМ NaCl

1,0 мМ КС1

2,4 мМ NaHC03

15,0 мМ HEPES —NaOH или трис-HCl, рН 7,6 0,30 мМ CaN03-4H20 0,41 мМ СаС12-6Н20 0,82 мМ MgS04-7H20 10 мкг/мл натриевой соли пенициллина 10 мкг/мл сульфата стрептомицина Приготовление2

A. Исходный раствор солей

NaCl 128 г КО 2 г

NaHC03 5 г

HEPES 89 г (или трис-основание 45 г)

Растворите реактивы в 1 л дистиллированной воды и доведите рН до< 7,6 концентрированной НС1 (если используется трис) или 1 ? NaOH (если используется HEPES). Доведите объем до 1 л. Храните порциями? по 40 мл при —20°С. Б. Исходный раствор двухвалентных катионов CaN03-4H20 1,90 г

СаС12-6Н20 2,25 г

MgS04-7H20 5,00 г

Растворите реактивы в 1 л дистиллированной воды. Храните порциями, по 40 мл при —20 °С.

B. Исходный раствор антибиотиков

Приготовьте свежий раствор натриевой соли пенициллина и сульфата стрептомицина с концентрацией 10 мг/мл каждый.

Для приготовления модифицированного солевого раствора Барта смешайте следующие компоненты в указанном порядке:

919 мл дистиллированной воды

40 мл исходного раствора солей А

40 мл исходного раствора двухвалентных катионов Б

1 мл исходного раствора антибиотиков В

1 При необходимости вводят следующие добавки: при изучении секреции гентамици» (100 мкг/мл), нистатин (20 ед./мл), а также в некоторых случаях (разд. 4.1) 5% диали-зованной телячьей или лошадиной сыворотки.

2 Все реактивы должны быть квалификации не ниже х. ч. (analytical grade).

много мелких ооцитов и других тканей яичника, которые иногда могут осложнять дальнейшие эксперименты. Большое количество изолированных ооцитов можно получить, либо просто отбирая их вручную, либо с помощью ферментативного «раздевания».

2.3.1. Извлечение ооцитов вручную

Если нет необходимости получить несколько тысяч ооцитов,, рекомендуется очищать их вручную. Зажмите крупный кусочек яичника (более 30 ооцитов) одним часовым пинцетом и отде-

336

Глава 10

'Рис. 2. Участок одной доли яичника показан вскоре после его извлечения ¦ из лягушки. Видны ооциты разных размеров на различных стадиях роста.

.лите от него ооциты другим пинцетом. Успех этой процедуры зависит от партии ооцитов, причем некоторые ооциты неизбежно повреждаются. Однако изолированные ооциты обычно инкубируют перед инъекцией в течение ночи, после чего поврежденные ооциты выявляются очень легко. Если при этом наблюдаются значительные разрушения, то можно попробовать извлекать отдельные ооциты из кусочков под стереомикроскопом. Манипулировать с выделенными ооцитами удобнее всего с помощью пастеровской пипетки с широким просветом.

2.3.2. Ферментативное «раздевание»

Осторожно перемешайте кусочки яичника с ооцитами 2—4 ч на магнитной мешалке при 18—24 °С в растворе Барта, в который добавлена коллагеназа (Sigma, Type II; концентрация 2 мг/мл). В результате ооциты освобождаются из фолликулов, но еще остаются окруженными тремя слоями соматических клеток.

3. Микроинъекции мРНК в ооциты

3.1. Необходимое оборудование

Для эффективных микроинъекций необходимы стереомикро-скоп, микроманипулятор, шприц, источник света и прибор для изготовления микропипеток. Некоторые из этих приборов изображены на рис. 3, Л и Б в рабочем состоянии для микроинъекций.

Трансляция зукариотической мРНК в ооцитах Xenopus

337

Рис. 3. Ооорудование для микроинъекций. А. Шприц, микроманипулятор и стереомикроскоп находятся в нормальном рабочем положении. Б. Шприц с автоматической подачей. Небольшой шприц с микрометром присоединен к моторчику, который управляется педалью через трансформатор. Трансформатор позволяет изменять скорость вращения микрометрического винта в диапазоне от 0 до 30 об/мин.

22—953

338

Глава 10

3.1.1. Стереомикроскоп

Подходит любой хороший стереомикроскоп, но предпочтителен микроскоп с переменным увеличением и большой глубиной резкости, так как во время микроинъекции желательно, чтобы сам ооцит и мениск жидкости в микропипетке были одновременно в фокусе.

3.1.2. Микроманипулятор

Наиболее удобен микроманипулятор с небольшим понижающим отношением (отношением размаха движений руки и движения самого манипулятора); его можно собрать на базе микроманипулятора Mark 1 фирмы Singer Instrument Company. Он лучше многих более мощных микроманипуляторов и позволяет производить движения в трех измерениях с понижающим отношением 4:1. Такие манипуляторы продают фирмы Singer Instrument Company и Oxford Microinstruments.

3.1.3. Шприц

Введение мРНК в ооцит основано на том, что к образцу в микропипетке прикладывается положительное давление, которое передается от шприца через гибкий полиэтиленовый шланг диаметром около 1 мм. Шприц и шланг заполнены медицинским вазелиновым маслом (оно продается в аптеке). Мы используем ручной микрошприц Alga фирмы Wellcome Reagents Ltd., тогда как Бирнстайл и его коллеги [66] предпочитают шприц на Ю мкл фирмы Hamilton, присоединенный к винтовому микродозатору с мотором. Сходная конструкция, но с использованием шприца Alga, изображена на рис. 3, Б. Автоматизированная система инъекций дает то преимущество, что при ее использовании одна рука остается свободной, благодаря чему введение раствора в ооциты можно проводить более воспроизводимо и количественно. В любом случае из системы нужно время от времени удалять воздух.

3.1.4. Источник света

Можно использовать любой осветитель для микроскопа. Однако лучше всего подходят лампы с волоконной оптикой (например, лампа с волоконной оптикой Schott фирмы Micro Instruments): они дают интенсивное освещение без нагревания, поэтому оо

страница 76
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(10.12.2019)