ичество ферментов, запасных белков и органелл, образующих материнский резерв для использования во время раннего развития эмбриона. Одна из поразительных черт раннего развития — резкое увеличение синтеза белка в результате интенсивной трансляции материнской мРНК после оплодотворения. Неудивительно, что значительную часть материнских запасных молекул представляют компоненты, необходимые для этого трансляционного взрыва, например рибосомы, тРНКит.д. [1, 2]. Но большая часть материнского резерва состоит из белков желтка, фосвитина и липовителлина. Именно накоплением больших количеств этих белков (~200 мкг на ооцит), поступающих из материнской крови, объясняются впечатляющие размеры зрелого ооцита X. laevis (диаметр —1,2 мм). Эти два свойства ооцита—наличие материнского резерва и крупные размеры — сделали его популярной тест-системой в исследованиях транскрипции [3], репликации [4], самосборки [5], распределения [6] и трансляции [7—10] инъецированных макромолекул. Настоящая глава посвящена способности ооцита транслировать инъецированную мРНК. Транскрипция ДНК, инъецированной в ооциты, описана в гл. 2.

Инъецированные мРНК транслируются в ооцитах Xenopus весьма эффективно. Это было впервые продемонстрировано Джоном Гердоном и его коллегами [11], которые наблюдали в ооцитах синтез глобинов после инъекции в них 9S-PHK из ретикулоцитов кролика. По оценке этих авторов, мРНК транслировались в ооците в 30 раз более эффективно, чем в лизате ретикулоцитов за такое же время инкубации. Более того, эту разницу между эффективностью ооцита и лизата можно было довести до 1000, просто культивируя ооциты достаточно долго. С тех пор было транслировано с помощью инъекции в ооциты множество самых различных РНК (табл. 1). В первой работе по синтезу глобина радиоактивный продукт — глобин — идентифицировали колоночной хроматографией. Хотя подобные приемы к настоящему времени большей частью вытеснены иммунологическими и электрофоретическими методами, прямое радио-

328

Глава 10

Таблица 1. РНК, транслированные с помощью микроинъекции в ооциты

Xenopus1

Источник мРНК

Источник данных

Вирусы

Аденовирус [j2!

Вирус мозаики альфальфа ?1?\

Вирус миелобластоза птиц [14]

Вирус саркомы птиц ?°?

Вирус мозаики ячменя [16]

Вирус бычьего лейкоза [17]

Вирус мозаики костра ['8]

Вироид томатов [19]

Вирус мозаики огурца [20]

Вирус энцефаломиокардита [21] Вирус гриппа Неопубликованные

данные2

Менговирус [22]

Вирус Молони [23]

Вирус опухоли молочной железы мыши [24]

Вирус полиомы [25]

Вирус бешенства [26]

Реовирус [27]

Обезьяний вирус 40 [25]

Вирус табачной мозаики [23]

Растения

Секреторные белки ячменя [25] Лактин клещевины Неопубликованные-

данные3

Запасные белки фасоли (Phaseolus vulgaris) [29]

Запасные белки кукурузы ?30]

Беспозвоночные

Промелитин пчелы [31]

Вителлины саранчи [32]

Гистоны морского ежа [33]

Позвоночные

а- и ?-Кристаллины хрусталика быка [34, 35] Прохимозин быка Неопубликованные

данные4

Тироглобулин быка [36]

Проинсулин карпа [37]

Ацетилхолиновый рецептор кошки [38]

Кональбумин курицы [39]

Лизоцим курицы [39]

Овальбумин курицы [39, 40]

Овомукоид курицы [39]

Глобин утки [41]

Альбумин лягушки [25]

Вителлогенин лягушки [25, 32)

Коллаген лягушки [42]

Продолжение

Источник мРНК

Источник данных

Казенны морской свинки ?-Лактальбумин морской свинки Иммуноглобулин человека

Интерферон человека

Хорионический гонадотропин человека

Глобин мыши

Интерферон мыши

Коллаген мыши

Иммуноглобулин мыши

?-Глюкуронидаза мыши

Тиротропин мыши

Иммуноглобулин свиньи

Глобин кролика

Утероглобулин кролика

Иммуноглобулин крысы

Цитохром крысы

Эпоксидгидратаза крысы

Белки семенных пузырьков крысы

Стероидсвязывающий белок предстательной

железы крысы Ацетилхолиновый рецептор электрического ската

Протамин форели

[43] [43]

Неопубликованные данные5

[44] [45] [41] [46] [7] [47-50] [51] [52] [53]

["] [54] [55] [56] [56] [57] [58]

[59]

[60]

' Более полный перечень источников даных см. в [7—10].

2 Colman ?., Dimmock N. Davey J.

3 Colman ?., Lord J. M.

4 Colman ?., Doel M., Harris T.

5 Colman ?., Williamson A.

Таблица 2. Посттрансляционные модификации чужеродных белков в ооцитах Xenopus1 Модификация Модифицируемый белок1 Источник данных

а-МН2-ацетилирование

е-МН2-ацетилирование ?-гликознлирование

Гидроксилирование Фосфорилирование Расщепление полибелка Ковалентная сборка единиц

субъ-

Нековалентная сборка субъединиц

Удаление сигнальной последовательности

Кристаллин аА2 хрусталика теленка

Гистоны морского ежа

Овальбумин курицы

Иммуноглобулины мыши

Коллаген фибробластов мыши

Протамин семенников форели

Вителлогенин Xenopus

Утероглобулин кролика

Иммуноглобулины из различных источников

Ацетилхолиновый рецептор Torpedo

Различные белки

[34]

[33] [39] [47] [7] [60] [61] [54] [48, 49, 55]

[59]

См. сноски в табл. 3

1 Приведены лишь отдельные примеры каждого типа модификаций.

330

Глава 10

Таблица 3. Правильная компартментация н секреция чужеродных 6^j"j°B» синтезированных в ооцитах Xenopus в результате инъекции мРНК

Окончательная Источник

Белок локализация данных

Мембраны ооцита

То же

»

Белки, остающиеся внутри ооцита

Эпоксидгидратаза печени крысы

Цитохром Р-450 печени крысы Запасные белки кукурузы Запасные белки фасоли Несекретируемый иммуноглобулин мыши1 Лектин клещевины1

Рецептор ацетилхолина »

Большой опухолевый антиген Ядро ооцита полиомы

Нуклеопротеин вируса гриппа То же

Фосвитин печени Xenopus Желточная

ооцита

Липовителлин печени Xenopus То же Белки, секретирующиеся из ооцита

пластинка

Низкомолекулярные

мян ячменя Прохимозин быка1

белки се-

Овальбумин курицы Кональбумин курицы Овомукоид курицы Лизоцим курицы1 Казенны морской свинки Интерфероны человека Вителлиновые полипептиды саранчи

Интерфероны мыши Тироидстимулирующий гормон мыши

Иммуноглобулины мыши1 Альбумин крысы Белки семенных пузырьков крысы1

[56]

[56! [30} [291 [48J

Неопубликованные данные2

[38, 59) [25]

Неопубликованные данные3

[61]'

[611

[25]

Неопубликованные данные4

[39]

[39]

[39]

[391

162]

[62]

[251

[461 [52]

[48—501 [25] [57]

1 Показано, что в ооците происходит отщепление сигнальных последовательностей-.

2 Colman ?., Lord J. ?.

3 Colman ?., Dimmock ?.

* Colman ?., Harris Т., Doel ?.

Трансляция эукариотической мРНК в ооцитах Xenopus

331

Таблица 4. Обнаружение с помощью биологических тестов чужеродных белков, синтезированных в ооцитах

Белок

Биологический тест

Источники данных

Интерфероны (различные)

Иммуноглобулины (различные) ?-Глюкуронидаза почек мыши Ацетилхолиновые рецепторы электрического органа ската и мышц кошки Вителлогенин Xenopus Цитохром Р-450 печени крысы Антигенспецифические супрес-сорные факторы мыши

Подавление активности виру- [44, 46, 62] сов

Связывание антигена [50, 55]

Ферментативная активность [51]

Связывание а-бунгаротоксина [38, 59]

Поглощение ооцитами [32] Ферментативная активность [56] Супрессорная активность [63]

активное мечение чужеродного белка остается наиболее широко распространенным подходом.

Для большинства повседневных опытов по изучению мРНК бесклеточные экстракты являются самой простой и дешевой системой трансляции. Но в некоторых случаях ооциты Xenopus имеют очевидные преимущества перед бесклеточными системами. Так, в отличие от бесклеточных систем в ооците проходят правильные посттранскрипционные модификации многих чужеродных белков, например процессинг предшественников, фосфорилирование и гликозилирование (табл. 2). Кроме того, в ооците белки способны встраиваться в те внутриклеточные мембраны, для которых они предназначены, а секретируемые белки могут экспортироваться (табл. 3). Наконец, биологически активные чужеродные белки, синтезированные в ооцитах, могут обладать своей природной активностью, даже если для этого необходимы сложные взаимодействия субъединиц. В подобных случаях для выявления продукта трансляции можно использовать какой-нибудь подходящий биологический тест, обеспечивающий большую чувствительность, чем обычный радиохимический анализ (табл. 4).

2. Получение и подготовка ооцитов для микроинъекций

2.1. Покупка и содержание Xenopus laevis

2.1.1. Покупка

Естественное место обитания лягушек X. laevis — Южная Африка. Мы издавна покупали лягушек у южноафриканских фирм, поскольку «дикие» животные крупнее и часто находятся

332

Глава 10

в лучшем состоянии, чем выведенные в лабораторных условиях. Однако если нужно лишь немного лягушек (<20), то оплата ухода за ними, воздушной перевозки и т. п. делают их импорт экономически невыгодным. К счастью, фирмы нескольких стран предлагают покупателю на выбор выведенных в лаборатории, содержавшихся в лаборатории или «диких» животных, например South African Snake Farm, Xenopus Ltd., Nasco. Адреса этих фирм даны в приложении II. Заказывая животных, не забудьте указать, какого пола лягушки вам требуются!

2.1.2. Содержание лягушек

Лягушек содержат в больших резервуарах с водой (3—4 л на одно животное). Глубина должна быть не больше 15 см, так как лягушки должны время от времени всплывать к поверхности, чтобы дышать. Проверьте, чтобы резервуары имели плотно прилегающие крышки (лучше всего из мягкой пластиковой сетки), иначе животные выскочат. Лишенные воды лягушки погибают от обезвоживания через 6 ч. Оптимальная температура воды ~19—21 °С. Можно использовать водопроводную воду, но необходимо избавиться от хлора и тяжелых металлов, если они присутствуют в высокой концентрации. Для этого достаточно оставить воду на 24 ч в широких открытых емкостях (чтобы улетучился хлор) или пропустить ее через ионообменную колонку для удаления тяжелых металлов.

2.1.3. Кормление

Лягушек достаточно кормить всего два раза в неделю. По нашему опыту лучший рацион включает грубо измельченную говядину в одно кормление и живых личинок мясных мух — в другое. Очищайте резервуары после каждого кормле