кую —инициация in vitro. Для того чтобы различить эти два процесса, можно определить кинетику включения аминокислот в присутствии и в отсутствие ингибитора инициации. На рис. 8 приведен результат такого эксперимента. Важно, чтобы ингибитор не влиял на элонгацию и терминацию; для этой цели хорошо подходит антибиотик эдеин, который имеется в продаже. Можно использовать также пактамицин (при концентрации 10 мкМ) или нетранслируемый гомополинуклеотид, например полиинозиновую кислоту (400 мкг/мл).

При работе с экзогенными мРНК, особенно в случае пред-ынкубированных и/или обработанных микрококковой нуклеазой экстрактов, можно провести опыты по конкуренции мРНК.

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

323

Экстракт нормальных клеток

Время, мин

Рис. 8. Действие ингибитора инициации трансляции на кинетику синтеза белка на эндогенной мРНК в экстрактах из клеток асцитной опухоли Эрлиха, растущих на полной среде и в условиях аминокислотного голодания. Реакционную смесь в объеме 50 мкл инкубировали, как указано в подписи к рис. 7, с меченым предшественником [3Н]-фенилаланином (50 мкКи/мл) в присутствии или в отсутствие эдеина (4 мкМ). Через указанные промежутки времени отбирали аликвоты объемом 5 мкл и измеряли радиоактивность, включившуюся в белок. Обратите внимание на быстрое прекращение-синтеза белка даже в отсутствие эдеина и на то, какая часть аминокислот включается в белок в результате инициации новых полипептидных цепей (общее включение за вычетом включения в присутствии эдеина).

Этот подход оказался особенно полезен при исследовании, например, взаимоотношений вирусных и хозяйских клеточных мРНК или для определения относительной эффективности трансляции различных мРНК в разных ионных условиях [59]. В таких исследованиях важно, конечно, иметь специфический тест на трансляцию каждой отдельной матрицы. Для этой цели широко используется анализ продуктов с помощью электрофореза в ПААГ—ДСН (разд. 5.2).

7.2.3. Проблемы и ограничения

Основной недостаток при использовании клеточных экстрактов для изучения физиологических изменений в клетках или тканях заключается в том, что по сути исследуют свойства экстрактов, а не самих клеток. Очевидно, что получение бесклеточных систем само по себе вносит определенные артефакты. По-

21*

324

Глава 9

следствия этих артефактов следует соотнести с преимуществами проведения таких экспериментов, которые невозможны на ин-тактных клетках или целых животных. Серьезным недостатком являются низкая трансляционная активность многих систем (разд. 4.6) и непродолжительность времени, в течение которого наблюдается инициация на эндогенной РНК. (рис. 8); эти проблемы требуют решения. Следует обратить внимание также на технические недостатки бесклеточных систем — кажущееся запасание мРНК в нетранслируемом виде и заметное расхождение между способностью некоторых систем из неэритроидных клеток млекопитающих образовывать комплексы инициации 405-метионил-тРНК! и способностью мРНК связываться с этими комплексами.

Еще одна сложная проблема — отсутствие реакции некоторых клеточных экстрактов на регуляторные сигналы, которые быстро и эффективно действуют на интактные клетки. Особенно загадочно различие в реакции клеток, подвергнутых аминокислотному голоданию, и экстрактов из них на восстановление концентрации недостающих аминокислот [60]. В целых клетках синтез белка регулируется на уровне инициации и при добавлении аминокислот восстанавливается в течение нескольких минут. В экстрактах из голодающих клеток добавление аминокислот, наоборот, совершенно не эффективно, хотя экзогенный фактор eIF-2 способен восстановить инициацию Г14].

Возможно, установив причины всех этих особенностей в поведении бесклеточных эукариотических систем, мы не только решим технические проблемы, но и больше узнаем о механизме синтеза белка у эукариот и его регуляции.

Благодарности

Я очень признателен многим коллегам, сообщившим мне полезные сведения о практических аспектах выделения и трансляции мРНК. Особенно я хотел бы поблагодарить Т. Ханта, Р. Джексона и С. Морли (Кембриджский университет) за предоставление неопубликованных данных и лабораторного руководства «Система трансляции лизата ретикулоцитов кролика». Я также благодарен д-рам Э. Хеншоу и Р. Паннирсу (Раковый центр Университета в Рочестере) за возможность ознакомиться с рукописью их статьи (Methods in Enzymology, в печати). Часть представленных здесь данных была получена в сотрудничестве с д-рами С. Остин, М. Мак-Нурлан, Дж. Круппа, Б. Уильямсом и И. Керром. Я благодарен В. Тийерей и 3. Бер-ридж за техническую помощь, Б. Бэшфорд за выполнение рисунков и В. Марвелл за подготовку рукописи. Эта работа фи-

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

325

нансировалась Career Development Award from the Cancer Research Campaign and by grants from the Medical Research Council and the Anna Fuller Fund.

Литература

1. Clemens M. J. ed. The Biochemistry of Cellular Regulation, vol 1 CRC Press, Boca Raton, p. 159, 1980.

2. Jackson R. J., Campbell ?. ?., Herbert P., Hunt T. Eur J Biochem 131 289 (1983).

3. Pelham H. R. В., Jackson R. J. Eur. J. Biochem., 67, 247 (1976)

4. Skup D., Millward S. Nucleic Acids Res., 4, 3581 (1977)

5. Palmiter R. D. J. Biol. Chem., 248, 2095 (1973).

6. Pelham H. R. В., Sykes J. ?. M., Hunt T. Eur. J. Biochem., 82, 199 (1978)

7. Cepko C. L., Hansen U., Handa H., Sharp P. A. Mol. Cell Biol., 1, 919

(1981) .

8. Kay J. E., Benzie C. R. Biochim. Biophys. Acta, 698, 218 (1982)

9. Roberts В. E., Paterson В. M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 2330 (1973)

10. Marcu K., Dudock B. Nucleic Acids Res., 1, 1385 (1974).

11. Kronenberg ?. M., Roberts В. E., Habener J. F., Potts J. ?, Rich A Nature 267, 804 (1977). '

12. Senger D. R., Gross P. R. Dev. Biol., 53, 128 (1976)

13. Mathews ?. B. Biochim. Biophys. Acta, 272, 108 (1972).

14. Pain V. M., Lewis J. ?., Huvos P., Henshaw E. C, Clemens ? J J Biol Chem., 255, 1486 (1980). ' '

15. Henshaw E. C, Panniers L. R. V. In: Methods in Enzymology, vol 101 Wu R., Grossman L. and Moldave K. (eds.), p. 616, 1983.

16. Tuite M. F., Plesset J., Moldave K., McLaughlin C. S. J. Biol Chem 255 8761 (1980).

17. Schreier ?. H., Staehelin T. J. Mol. Biol., 73, 329 (1973)

18. Trachsel H., Erni В., Schreier ?. H., Staehelin T. J Mol Biol 116 755 (1977). '

19. Esteban M., Kerr I. M. Eur. J. Biochem., 45, 567 (1974).

20. Weber L. ?., Feman E. R., Baglioni C. Biochemistry (Wash.), 14, 5315 (1975).

31. Austin S. ?., Clemens M. J. Eur. J. Biochem., 117, 601 (1981)

22. Hames B. D., Rickwood D., eds. Gel Electrophoresis of Proteins IRL Press Ltd., Oxford and Washington, DC, 1981.

'23. Dobos P., Kerr I. ??., Martin ?. M. J. Virol., 8, 491 (1971)

'24. Heywood S. M., Rourke A. W. In: Methods in Enzymology vol. 30 Moldave K. and Grossman L. (eds.), Academic Press, New York and London p. 669, 1974.

¦25. Woodward W. /?., Wilairat P., Herbert E. In: Methods in Enzymologv yol. 30, Moldave K. and Grossman L. (eds.), Academic Press, New York and London, p. 740, 1974.

•26. Devillers-Thiery ?., Kindt Т., Scheele G., Blobel G. Proc Natl Acad Sci USA, 72, 5016 (1975).

27. Smith A. E. Eur. J. Biochem., 33, 301 (1973)

28. Wigle D. Т., Smith A. E. Nature New Biol 242 136 (1973)

29. Raj N. В. K., Pitha P. M. Proc. Natl. Acad. Sci USA 74' 1483 (19771

30. Hruby D. E., Ball P. M. J. Virol., 40, 456 (1977) K h

31. Davis B. D., Tai P.-C. Nature, 282, 433 (1980).

32. Sabatini D., Kreibich G., Morimoto Т., Adesnik M. J. Cell Biol., 92 1

(1982) . '

33. Blobel G., Dobberstein B. J. Cell Biol., 67, 852 (1975).

326

Глава 9

34 Strauss A. W., Zimmerman ?., Boime I., Ashe В., Mumford R. ?., Alberts A. W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4225 (1979).

35. Walter P., Ibrahimi 1., Blobel G. J. Cell Biol., 91, 545 (1981).

36. Rotham J. E., Lodish H. F. Nature, 269, 775 (1977).

37 Scheele G., Dobberstein В., Blobel G. Eur. J. Biochem., 82, 593 (1978).

38. Shields D., Blobel G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 2059 (1977).

39. Pelham H. R. B. Eur. J. Biochem., 85, 457 (1978).

40. Proud C. G., Clemens M. J., Pain V. M. FEBS Lett., 148, 214 (1982).

41. Darnbrough C, Legon S., Hunt Т., Jackson R. J. J. Mol. Biol, 76, 37» (1973).

42. Jagus R., Safer B. J. Biol. Chem., 254, 6865 (1979).

43. Austin S. ?., Clemens M. J. FEBS Lett., 110, 1 (1980).

44 Farrell P. J., Balkow K., Hunt Т., Jackson R. J., Trachsel H. Cell, 11, 187 (1977).

45 Leroux ?., London I. M. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 79, 2147 (1982).

46. Wong S.-T., Mastropaolo W., Henshaw E, C. J. Biol. Chem., 257, 5231 (1982).

47. Clemens M. J., Williams B. R. G. Cell, 13, 565 (1978).

48. Williams B. R. G., Gilbert C. S., Kerr 1. M. Nucleic Acids Res., 6, 1335 (1979).

49 Sarkar S, Mukherjee A. K., Guha C. J. Biol. Chem., 256, 5077 (1981).

50. Fresno M., Vazquez D. Eur. J. Biochem., 103, 125 (1980).

51 Hastie N. D., Held W. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1217 (1978).

52. Austin S. ?., Kay J. E. Biochim. Biophys. Acta, 395, 468 (1975).

53. Lenz J. R., Chatterjee G. ?., Maroney P. ?., Baglioni C. Biochemistry (Wash.), 17, 80 (1978).

54. Fischer I., Moldave K. Anal. Biochem., 113, 13 (1981).

55. Ahem Т., Sampson J., Kay E. Nature, 248, 519 (1974).

56. Gasior E., Herrera F., McLaughlin C. S., Moldave K. J. Biol. Chem., 254, 3970 (1979).

57. Pain V. M., Henshaw E. C. Eur. J. Biochem., 57, 335 (1975).

58. Austin S. ?., Kay J. E. In: Essays in Biochemistry, vol. 18, Campbell P. N. and Marshall R. D. (eds.), The Biochemical Society London, p. 79, 1982.

59 Brendler Y., Godefroy-Colburn Т., Carlill R. D., Thach R. E. J. Biol. Chem., 256, 11747 (1981).

60 Austin S. ?., Pain V. ??., Lewis J. ?., Clemens M. J. Eur. J. Biochem., 122, 519 (1982).

61. RajBhandary U. L., Ghosh H. P. J. Biol. Chem., 244, 1104 (1968).

глава 10

ТРАНСЛЯЦИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ МАТРИЧНОЙ РНК В ООЦИТАХ XENOPUS

А. Колмен

1.Введение

Во время оогенеза в ооцитах Xenopus laevis накапливается большое кол