Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

и оставьте суспензию во льду на 10 мин.

5. Добавьте 50 мкл 0,25 ? ЭДТА и разбавьте каждую суспензию путем постепенного добавления 1,3 мл буфера, содержащего 9%-ную сахарозу, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0.

6. Реципиентные клетки должны расти на среде Игла в модификации Дуль-бекко (среда DME, Gibco) в чашках Петри диаметром 3,5 см до плотности культуры 2-Ю5 клеток на чашку.

7. Слейте среду и промойте реципиентные клетки один раз 2 мл солевого раствора, забуференного трис-HCl (0,15 ? NaCl, 20 мМ трис-HCl, рН 7,2).

8. Добавьте 2 мл препарата протопластов Е. coli (см. п. 5) к каждой чашке и отцентрифугируйте протопласты на слой клеток (1500 об/мин, 3 мин) в большом бакет-роторе на настольной центрифуге.

9. Слейте супернатант и добавьте 0,5 мл 48%-ного (по весу) полиэтилен-гликоля (ПЭГ 1000) в среде DME. Проинкубируйте при комнатной температуре 1 мин.

10. Осторожно промойте клетки пять раз солевым раствором, забуференным трис-HCl.

11. Добавьте свежую ростовую среду (среда DME, содержащая сыворотку новорожденного теленка в концентрации 10%). Проинкубируйте при 37 °С.

12. Меняйте среду каждый день. Через 10 сут проверьте культуры на на-личие трансформированных колоний.

1 Нужный для амплификации антибиотик зависит от используемой рекомбинантной-плазмиды.

32

Глава 1

осуществляются со 100% -ной вероятностью [31]. После переноса ДНК, содержащей ранние гены вируса полиомы или SV40, эффективность образования фокусов трансформации по крайней мере не меньше, чем после инфицирования вирусными частицами. В оптимальных условиях перенос при слиянии, по-видимому, происходит с эффективностью, в 10—20 раз большей, чем введение ДНК в клетки млекопитающих с помощью каль-¦ций-фосфатной методики. Метод слияния протопластов описан "в табл. 11.

2.6. Другие методы переноса генов

2.6.1. Перенос генов с помощью хромосом

Перенос генов с помощью хромосом состоит во введении ме-тафазных хромосом в реципиентные клетки. Изолированные -метафазные хромосомы обычно переносят либо кальций-фос-чратным методом [32, 33], либо с помощью включения их в липосомы [34]. Эта система в принципе может быть очень эффективной, но ситуация осложняется тем, что пока отсутствуют способы длительного хранения хромосом и включения в них клонированной ДНК. Если бы удалось включить клонированную ДНК в структуры, содержащие сигнальные последовательности, регулирующие стабильную сегрегацию и передачу генетической информации, то потенциальные возможности такой (Системы были бы столь велики, что многие дальнейшие исследования велись бы именно в этом направлении.

2.6.2. Упаковка in vitro ДНК вирусов эукариот

Большого внимания заслуживают также системы переноса, юснованные на упаковке in vitro последовательностей ДНК вирусов эукариот, аналогичные системам на основе фага ? в случае прокариот. Недавно был описан перенос генов с помощью частиц, подобных вирусу полиомы [35].

2.6.3. Использование электростимуляции

Введение экзогенной ДНК в клетки с помощью электрости-.муляции было описано еще в 1982 г. [36], однако этот метод -еще не настолько хорошо разработан, чтобы рассматривать возможность применения его на практике.

2.7. Выбор метода переноса геноз

Очевидно, что выбор метода зависит от поставленной задачи. В большинстве случаев оптимальным является кальций-.фосфатный метод с использованием клонированной ДНК или ДНК, выделенной непосредственно из эукариотических клеток.

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

33

Это достаточно простой, быстрый, хорошо воспроизводимый и весьма эффективный метод. Применение ДЭАЭ-декстрана рекомендуется только в некоторых частных случаях, таких, как трансфекция полиовирусной РНК или ДНК паповавирусов. Сложившееся ранее представление, что при микроинъекции достигается значительно большая эффективность переноса, чем в случае кальций-фосфатной методики, возможно, придется пересмотреть в свете новых исследований, проведенных с более точным сравнением эффективности. Однако, если число реципиентных клеток ограничено или если донорной ДНК очень мало, микроинъекция дает реальные преимущества. Липосом-ный метод заведомо более сложный, чем кальций-фосфатный, и не более эффективный. Возможно, липосомы окажутся полезными в некоторых опытах in vivo, но и это предположение нужно еще подтвердить. Метод слияния протопластов, вероятно, более эффективен, чем кальций-фосфатная преципитация, и может послужить основой для прямого скрининга библиотек рекомбинантных плазмид по экспрессии включенных генов в клетках эукариот.

3. Селектируемые маркеры

Селектируемые маркеры — это гены, экспрессия которых в клетках дает возможность проводить позитивную селекцию. В узком смысле они кодируют такие генные продукты (биохимические маркеры), присутствие которых может быть выявлено путем введения в ростовую среду простых химических соединений, и являются, таким образом, чрезвычайно полезными для отбора трансформантов в экспериментах по переносу генов (разд. 2). Однако отбор можно проводить и по многим другим фенотипическим признакам, например по способности к росту в агаре или по снижению потребности в сыворотке (их обусловливают доминантные трансформирующие гены, изменяющие регуляцию роста). Использование селектируемых маркеров позволило глубже понять механизмы трансфекции и дало возможность получить системы для анализа регуляции транскрипции. Несколько селектируемых генов, имеющих практическое применение, описаны в разд. 3.1, а доминантные трансформирующие гены, изменяющие регуляцию роста, рассмотрены в разд. 3.2.

3.1. Биохимические маркеры 3.1.1. Тимидинкиназа

Гены тимидинкиназы [tk) экспрессируются в большинстве эукариотических клеток. Этот фермент является участником дополнительного метаболического пути синтеза тимидиновых

3—953

34

Глава 1

Таблица 12. Определение активности тимидинкиназы, кодируемой HSV-1 [42]

1. Трипсинизируйте клетки и промойте их буфером PBS (табл. 3, п. 1).

2. Ресуспендируйте клетки до концентрации 0,2—2,0· 107 клетка/мл в буфере 50 мМ трис-HCl, рН7,5, 5 мМ 2-меркаптоэтанол, 5 мкМ тимидин.

3. Разрушьте клетки ультразвуковой обработкой. При необходимости разрушенные клетки можно хранить при —70 °С. Анализируйте клетки на тимидинкиназную (ТК) активность в течение недели.

4. ТК-активность проверяйте в 100 мкл реакционной смеси, содержащей 5—20 мкл лизированных клеток, 50 мМ трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ MgCl2, 10 мМ АТР, 4,4 мкМ немеченный тимидин, 5 мкКи [3Н]-тимидина (удельная активность 30 Ки/моль) и 0,2 мМ ТТР. ТТР в такой концентрации ингибирует активность клеточной ТК, но не влияет на вирусную ТК. Проинкубируйте реакционную смесь при 37 °С.

5. Через 1, 2 и 4 ч отберите пробы по 25 мкл для определения степени превращения тимидина в ??1? следующим образом.

6. Первый способ

а) Добавьте к каждой пробе по 1 мл охлажденной во льду смеси: 4мМ формиат аммония (рН 6,0), 5 мкМ тимидин для того, чтобы остановить реакцию;

б) нанесите каждую пробу на круглый фильтр DE81 (Whatman; диаметр 2,3 см) путем фильтрования с отсосом;

в) промойте каждый фильтр два раза 2 мл охлажденного во льду раствора, содержащего фосфат аммония и тимидин;

г) далее промойте каждый фильтр дважды 2 мл дистиллированной воды и затем этанолом; при этом тимидин отмоется, а фосфат тимидина останется на фильтре;

д) высушите фильтры и определите радиоактивность с помощью сцинтил-

ляционного счетчика. Второй способ

а) нанесите капли реакционной смеси прямо на фильтры DE81, предварительно пронумерованные карандашом;

б) сразу опустите фильтры в ледяную воду и хорошо промойте их большими объемами воды;

в) промойте фильтры ацетоном, высушите их и определите связавшуюся радиоактивность с помощью сцинтилляционного счетчика.

нуклеотидов и катализирует превращение тимидина в тимидин-монофосфат. Получены ТК~-мутанты ряда клеток в культуре ([37—39]; см. также рис. 4). Селективная среда для отбора ТК+-клеток (среда HAT) была впервые описана в работах [40, 41]. Эта среда содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Аминоптерин ингибирует перенос одноуглеродных фрагментов и, таким образом, подавляет синтез ТТР из dUMP, а также синтез dATP и dGTP de novo. Гипоксантин является субстратом дополнительного пути синтеза dATP и dGTP, поэтому в его присутствии эти нуклеотиды синтезируются. Однако в среде HAT синтез ТТР целиком зависит от экзогенного источника тимидина и от наличия активного /&-гена. Итак, среда HAT является селективной для ТК+-клеток. Обычный состав среды HAT, пригодной для большинства клеток млекопитаю-

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

35

Рис. 7. Активность HSV-кодируемой

тимидк-нкиназы в LATK+ -клетках мыши и ВНКТК+-клетках хомячка через 3—4 мес после трансформации рекомбинантной плазмидой рТК1. Активность ТК определяли в присутствии 0,2 мМ ТТР в экстрактах, приготовленных из 1-105 клеток, по методу, описанному в табл. 12. / и // — ТК+-трансформанты клеток LAT-1 и ВТ-1 соответственно; темные кружки и темные треугольники — нетрансформированные клетки LATK- и ВНКТК-.

Время, ч

щих, и процедура отбора описаны в табл. 1. Таким образом, в ТК~-клетки могут быть введены гены тимидинкиназы и проведена селекция трансформантов ТК.+ на среде HAT. Наиболее известные ТК~-реципиенты — это LATKr-клетки мыши, характеризующиеся низким уровнем спонтанной реверсии и высокой эффективностью трансфекции. Лучше других изучен /fe-ген HSV-1; проведено его клонирование и определена нуклеотид-ная последовательность.

Активный tk-ren HSV можно выявить в трансфицированных клетках с помощью различных методов обнаружения активной HSV-кодируемой тимидинкиназы [10, 42]. Исследование активности этого фермента, описанное в табл. 12, основано на измерении превращения меченого радиоактивного тимидина в ти-мидинфосфаты. Поскольку для фермента, кодируемого вирусной ДНК, субстратная специфичность и регуляция по типу обратной связи отличаются от таковых для «клеточного» фермента, остаточную «клеточную» активность в ТК~-клетках можно избирательно ингибировать путем добавления 0,2 мМ ТТР, что позволяет измерять только

страница 7
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(09.12.2019)