попытаться оценить содержание различных видов мРНК в смеси или в разных препаратах. Существует много способов изучения продуктов трансляции; большинство из них основано на включении в белки радиоактивных аминокислот во время синтеза. Ниже вкратце рассмотрены наиболее распространенные методы изучения продуктов трансляции.

5.1. Стимуляция включения аминокислот

Как описано в разд. 2—4, существует несколько типов мРНК-зависимых систем трансляции, т. е. систем, в которых в отсутствие экзогенной мРНК наблюдается очень слабое включение

302

Глава 9

аминокислот или его не наблюдается вообще. Если при этом добавляется чистая мРНК. только одного вида, то уровень включения аминокислот в таких системах должен непосредственно отражать количество синтезированного продукта. Однако всецело полагаться на эти данные не следует, поскольку важно убедиться, что мРНК транслируется правильно и полностью. Далее, не исключено, что добавление экзогенной мРНК стимулирует трансляцию остаточной эндогенной мРНК (например, защищая ее от нуклеаз). Наконец, если транслируется смесь мРНК, включение аминокислот лишь указывает, что происходит синтез каких-то белков, ничего не говоря об их природе. По всем этим причинам в тех случаях, когда необходима информация о природе синтезируемого продукта, следует использовать те или иные методы из числа перечисленных ниже.

5.2. Электрофорез в ПААГ — ДСН

Для анализа продуктов трансляции в бесклеточных системах наиболее широко применяется универсальный метод электрофореза в пластинках ПААГ в денатурирующих условиях в присутствии ДСН. В сочетании с радиоавтографией или флюорографией высушенных гелей этот метод позволяет разделять в одной пробе большое число радиоактивных белков с различной молекулярной массой. Поэтому он прекрасно подходит для изучения продуктов синтеза в бесклеточной системе, функционирование которой зависит от нескольких мРНК. Еще больше возможностей дает анализ с помощью двумерного разделения в ПААГ: изоэлектрического фокусирования в первом направлении и электрофореза в ПААГ—ДСН во втором; такой анализ выявляет еще больше полипептидных продуктов. Методики электрофореза были недавно описаны в одном из томов настоящей серии [22], поэтому здесь мы ограничимся обсуждением вопросов подготовки образца для нанесения на гель.

Очень важно, чтобы полипептидные продукты обладали достаточно высокой удельной радиоактивностью, тогда для их выявления не понадобится слишком продолжительная экспозиция рентгеновской пленки. Если использовать в реакции [35S]-метионин в концентрации до 500 мкКи/мл, можно получить высокомеченый белок при сравнительно небольших расходах, хотя следует иметь в виду, что есть полипептиды, в которых эта аминокислота встречается редко или вообще отсутствует. Для электрофореза в ПААГ—ДСН всю реакционную смесь следует развести буфером для нанесения, содержащим ДСН, '2-меркаптоэтанол, глицерол, трис-HCl и бромфеноловый синий, ¦чтобы получить следующие конечные концентрации:

2%-ный ДСН

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

20%-ный глицерол

70 мМ 2-меркаптоэтанол

0,001%-ный бромфеноловый синий

60 мМ трис-HCl (рН 6,8) Образцы нужно прокипятить в течение 3 мин перед нанесением' на гель или хранить при —20°С, пока они не понадобятся. Пластинчатые гели нельзя перегружать по общему количеству нанесенного белка, так как при этом ухудшается разрешение. Это особенно важно в отношении лизатов ретикулоцитов, содержащих огромное количество гемоглобина. Обычно на одну дорожку пластинчатого геля толщиной 0,15 см можно нанести не более 5 мкл трансляционной смеси (разведенной в 5—10 раз-буфером для нанесения). На параллельную дорожку следует нанести маркеры молекулярной массы, чтобы откалибровать гель. Если есть радиоактивные маркеры, их следует смешать с немеченым клеточным экстрактом, чтобы маркеры и продукты трансляции находились в геле в одинаковых условиях. Важно нанести также контрольный образец, не содержащий мРНК, чтобы проверить, нет ли в смеси меченых белков, которые некодируются экзогенной матрицей. В лизате ретикулоцитов, обработанном нуклеазой, [35S]-метионин часто включается в какой-то полипептид с мол. массой 42 кДа в реакции, которая; вообще не связана с синтезом белка! Если необходимо, небольшие меченые новообразованные пептиды, еще присоединенные к тРНК, можно удалить, обработав пробы панкреатической рибонуклеазой в концентрации 100 мкг/мл в течение 10 мин при 30 °С перед добавлением буфера для нанесения.

Следует также остановиться на интерпретации данных по* радиоавтографии меченых продуктов бесклеточной трансляции. Как видно из рис. 4, гомогенная мРНК одного вида транслируется иногда с образованием широкого спектра продуктов в зависимости от того, какая система используется. Это наблюдается в первую очередь при трансляции больших вирусных. РНК и может быть связано как с преждевременной термина-цией синтеза в определенных участках мРНК, так и с посттрансляционным расщеплением больших полипептидных продуктов (разд. 6.2).

5.3. Иммунопреципитация продуктов трансляции

Надежную идентификацию и количественное определение-продуктов бесклеточного синтеза может обеспечить иммунологический анализ, если только имеются соответствующие антитела. Это особенно важно при изучении трансляции смеси большого числа разных мРНК, дающих множество полипептидов. В литературе можно найти многочисленные примеры использо-

304

Глава 9

Рис. 4. Радиоавтография продуктов трансляции после электрофореза в ПААГ—ДСН. РНК вируса ЭМК (40 мкг/мл) транслировали впредынкуби-рованном и диализованном экстракте из культуры мышиных L-клеток (разд. 4) в присутствии [355]-метнонина (100 мкКи/мл) в течение 150 мии при 30 °С. Аликвоты по 35 мкл после соответствующей обработки наносили для анализа меченых продуктов на 7,5%-ный ПААГ с ДСН, затем гель сушили и проводили радиоавтографию. Относительные молекулярные массы основных ВЭМК-специфических полипептидов указаны слева. Обратите внимание, что при трансляции очищенной индивидуальной мРНК образуется много полипептидов. Дорожка 1—контрольная инкубация; 2 — то же, с до-

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

305

вания иммунопреципитации для анализа продуктов бесклеточной трансляции. Выбор оптимального подхода зависит от свойств имеющихся антител и исследуемого антигена. Прежде всего необходимо принять все меры для предотвращения загрязнения системы в результате неспецифической преципитации посторонних меченых белков или адсорбции белков на стенках пробирок во время промывки нерастворимых комплексов антигенов с антителами. Чтобы проверить, не загрязнен ли конечный продукт, нужно провести электрофорез в ПААГ—ДСН с последующей радиоавтографией или флюорографией.

Применимая для большинства случаев методика иммунопреципитации описана в табл. 13. Введение неионного или ионного детергента во время иммунопреципитации и последующих промывок помогает снизить неспецифическое загрязнение комплексов антиген — антитело — белок А — сефароза, но следует отметить, что некоторые комплексы антиген —антитело диссоциируют в присутствии детергентов. Именно по этой причине, в частности, важно проводить предварительные эксперименты, чтобы подобрать условия для получения максимального выхода иммунопреципитата при минимальном приемлемом уровне загрязнения. При последней промывке следует исключить детергент, поскольку его присутствие может привести к искажению результатов электрофоретического разделения продуктов трансляции в ПААГ—ДСН.

5.4. Анализ триптических пептидов

Еще один весьма специфический способ проверки правильности трансляции состоит в исследовании набора радиоактивных пептидов, которые получаются при гидролизе белка трипсином. Этот подход можно использовать применительно ко всей реакционной смеси, если матрицей служит очищенная индивидуальная мРНК; в противном случае его можно применять для исследования иммунопреципитированного материала или отдельных полос в геле, если их радиоактивность достаточно вы-

бавлением пострибосомного супернатанта L-клеток, обработанных интерфероном; 3 — то же, с добавлением двухцепочечной РНК (1 мкг/мл); 4 — то же, с добавлением экстракта обработанных интерфероном клеток и двухцепочечной РНК (1 мкг/мл); 5 — то же, но РНК вируса ЭМК добавлена через 30 мин после начала инкубации; 6 — условия как для дорожки 4, но РНК вируса ЭМК добавлена после 30 мин инкубации. Обратите внимание на способность системы транслировать РНК, добавленную даже через 30 мин после начала инкубации, и подавление трансляции на 80—90% в образцах, проанализированных на дорожках 4 и 6. Ингибирование обусловлено индукцией 2',5'-олигоаденилатсинтетазы и протеинкиназы под действием интерферона. Оба фермента активируются двухцепочечной РНК и подавляют синтез белка (разд. 7).

20—953

306

Глава 9

Таблица 13. Иммунопреципитация продуктов трансляции1

1. По окончании инкубации бесклеточной системы трансляции разведите реакционную смесь в 5—10 раз буфером для иммунопреципитации:

0,1 ? NaCl 1 мМ ЭДТА 1%-ный нонидет Р-40 10 мМ трис-HCl (рН 7,5)

2. Добавьте нужный объем антисыворотки (его следует определить в предварительных экспериментах) и оставьте смесь на 3 ч при комнатной температуре, чтобы образовался комплекс антиген—антитело.

3. Проведите одну из следующих процедур.

а. Добавьте антиген-носитель и избыток антител, чтобы образовался иммунопреципитат комплексов меченого антигена с антителами.

б. Добавьте сефарозу с ковалентно пришитым белком А, чтобы адсорбировать комплексы.

Необходимые количества этих компонентов зависят от используемой антисыворотки, и их следует определить экспериментально.

4. Проинкубируйте смесь, встряхивая ее в течение 40 мин в маленькой пластиковой пробирке с круглым дном при 20 °С.

5. Перенесите материал в коническую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Отцентрифугируйте 1 мин при 14 000g.

6. Отберите и отбросьте супернатант. Трижды промойте осадок, ресуспенди-руя его в 1 мл буфера для иммунопреципитации с последующим центрифугированием.

7. Ресуспендируйте осадок в 0,1 м