трактов (разд. 3.2).

3.4. Преимущества и недостатки

Наиболее очевидные достоинства системы зародышей пшеницы — простота приготовления и низкая стоимость. В отличие от системы лизата ретикулоцитов отсутствуют проблемы, связанные с необходимостью содержать животных в специальных условиях, а приготовление большого числа различных экстрактов для сравнения их активности занимает немного времени. Кроме того, экстракты зародышей пшеницы в отличие от необработанного лизата ретикулоцитов чувствительны к стимуляции общего синтеза белка при добавлении экзогенной мРНК без предварительной обработки микрококковой нуклеазой. Если необходимо, и без того низкое фоновое включение можно еще более понизить с помощью обработки микрококковой нуклеазой (разд. 3.3). В оптимальных условиях при наличии высокоактивной мРНК эффективность включения аминокислот может возрасти до 400 раз. Система зародышей пшеницы была также использована в сочетании с системами транскрипции in vitro

294

Глава 9

для синтеза полипептидных продуктов, кодируемых вирусными и комплементарными ДНК [11]·

Недостатки этой системы заключаются в том, что оптимальные ионные условия трансляции очень сильно зависят от природы и концентрации мРНК и может понадобиться подбирать их специально для каждой матрицы. Кроме того, имеются данные Г12], что при низких уровнях стимуляции добавление экзогенной РНК приводит и к увеличению эндогенного синтеза белка, поэтому наблюдаемые продукты могут кодироваться не только исследуемой РНК. Но самый большой недостаток состоит в том, что у системы зародышей пшеницы наблюдается тенденция к синтезу неполноразмерных продуктов из-за преждевременной терминации — трансляции и высвобождения пеп-тидил-тРНК. Это может оказаться серьезной проблемой при трансляции длинных мРНК, кодирующих полипептиды с мол. массой, превышающей 60 кДа. Однако эту трудность можно-преодолеть, добавив в систему полиамины спермидин и спермин, которые увеличивают скорость элонгации цепи (до уровня,, сравнимого с таковым для лизатов ретикулоцитов) и снижают оптимальную концентрацию Mg2+. Поскольку в системе зародышей пшеницы происходит некоторое расщепление длинных: мРНК под действием эндонуклеаз, при добавлении полиаминов повышается вероятность того, что синтез полноразмерных продуктов успеет осуществиться до деградации матрицы.

4. Другие эукариотические бесклеточные системы

Помимо широко используемых систем лизата ретикулоцитов и зародышей пшеницы для трансляции экзогенных мРНК или для исследования регуляции синтеза белка применялось множество экстрактов разных эукариотических клеток. Как правило, эти системы представляют собой супернатанты, полученные путем центрифугирования клеточных суспензий при 10 000— 30 000 g, предынкубированиые или обработанные нуклеазой для удаления эндогенной мРНК и затем диализованные или пропущенные через сефадекс G-25 для стандартизации ионных условий. Такие супернатанты обычно получают из суспензионных клеточных культур, выращенных в большом объеме, или из асцитных опухолей мышей. В последнем случае легко получить большое количество материала, но с этим объектом непросто работать, если изучается влияние изменения клеточной физиологии на трансляцию.

В качестве источника бесклеточной системы широко использовались клетки мышиной асцитной опухоли Кребс-П. Эта система транслирует экзогенные клеточные и вирусные мРНК [13]. Экстракты со сходными свойствами можно получить из

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

295

мышиных L-клеток, клеток асцитной опухоли Эрлиха, Не La, клеток яичника китайского хомячка (СНО); все эти клетки можно культивировать в большом объеме (много литров). Описанная в настоящей главе методика с успехом применялась для клеток асцитной опухоли Эрлиха [14, 15] и, по-видимому, может использоваться в случае других типов клеток, перечисленных выше.

4.1. Получение экстрактов клеток асцитной опухоли Эрлиха

Методика приготовления экстрактов описана в табл. 11. Сразу после получения экстракт можно заморозить аликвотами по 200 мкл в жидком азоте, или провести предварительную инкубацию (разд. 4.2), или обработать микрококковой нуклеазой (разд. 4.4), чтобы понизить фон эндогенного синтеза белка. Цитоплазматические экстракты, приготовленные этим методом из клеток Эрлиха, содержат 60—100 Л260 ед. в 1 мл, а выход составляет 4 мл из 109 клеток.

Таблица 11. Приготовление экстракта клеток асцитной опухоли Эрлиха

Все процедуры следует проводить при 4 °С.

1. Соберите клетки, выращенные до плотности ~10а клеток/мл, центрифугированием в течение 5 мин при 1000g при 4 "С1.

.2. Слейте супернатант, ресуспендируйте клетки в 250 мл 0,15 ? NaCl, 20 мМ HEPES (доведите рН до 7,2 раствором КОН) и отцентрифугируйте, как указано в п. 1.

.3. Повторите этап 2.

•4. Измерьте объем осажденной клеточной массы, отцентрифугировав ее в градуированной конической центрифужной пробирке.

•5. Дайте клеткам набухнуть, суспендировав их в двух объемах 10 мМ КС1, 1,5 мМ ацетата магния, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 10 мМ HEPES (доведите рН до 7,5 раствором КОН) (гипотонический буфер). Оставьте суспензию на 10 мин во льду.

'6. Гомогенизируйте суспензию 20 движениями пестика в гомогенизаторе Даунса с минимальным зазором или лизируйте клетки, добавив нонидет Р-40 до концентрации 0,25%.

7. Добавьте следующий раствор в объеме, составляющем 0,4 объема клеточной массы:

0.55 ? КС1

2,5 мМ спермидин

3,5 мМ 2-меркаптоэтанол

50%-ный глицерол

0,1 ? HEPES (доведите рН до 7,5 раствором КОН)

8. Отцентрифугируйте смесь 10 мин при 20 000g при 4°С.

9. Соберите постмитохондриальный супернатант, стараясь не захватывать жировую пленку. Этот супернатант можно хранить, предынкубировать паи обрабатывать микрококковой нуклеазой (см. разд. 4.1).

• Если необходимо сохранить эндогенные полисомы, клетки следует прежде ¦быстро охладить. Для этого культуру смешивают с равным объемом измельченного в центрифужных стаканах.

296

Глава 9

При желании экстракты клеток можно диализовать (четыре смены буфера в течение 4 ч) или пропустить через сефадекс G-25 (грубый) (не менее 5 мл смолы на 1 мл экстракта) при 4°С, чтобы понизить концентрации аминокислот и стандартизовать концентрации ионов перед хранением. В обоих случаях лизат уравновешивают буфером, содержащим 90 мМ КС1, 2 мМ ацетат магния, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 10 мМ HEPES (оттитрованный КОН до рН 7,6). После пропускания через сефадекс обычно происходит разбавление экстракта в 2—3 раза.

4.2. Предынкубации клеточных экстрактов

Когда клеточные экстракты инкубируют при 37 °С в условиях, оптимальных для белкового синтеза (разд. 4.3), происходит трансляция эндогенной мРНК. Обычно это приводит к завершению синтеза предсуществовавших полипептидных цепей при низком уровне реинициации (см. разд. 7.2). Вследствие этого полисомы распадаются и накапливаются одиночные рибосомы; этот процесс часто называют «соскальзыванием» рибосом (run-off). Эндогенная мРНК либо расщепляется нуклеаза-ми, либо остается в виде нетранслируемых РНП-комплексов. в зависимости от происхождения бесклеточной системы. В любом случае фоновый уровень белкового синтеза падает практически до нуля, что позволяет изучать трансляцию только экзогенных мРНК.

Предынкубацию клеточных экстрактов проводят следующим образом. К 1 объему свежеприготовленного экстракта добавляют 0,1 объема раствора, содержащего 10 мМ АТР, 2 мМ GTP> 0,1 ? креатинфосфат и 1,6 мг/мл креатинфосфокиназы, и инкубируют 45 мин при 37°С. Центрифугируют 5 мин при 16 000 g при 4°С, диализуют супернатант или пропускают его через сефадекс G-25, как описано выше (разд. 4.1), и замораживают небольшими аликвотами. Приготовленные таким образом предынкубированные системы остаются стабильными в жидком азоте до 2 лет, но размораживать их для использования можно только один раз.

4.3. Условия инкубации для синтеза белка

В табл. 12 приведены конечные концентрации солей, аминокислот и соединений — источников энергии, необходимых для оптимальной трансляции как эндогенных, так и добавленных мРНК в экстрактах клеток Эрлиха и других аналогичных системах. Реакцию обычно проводят в объеме 25—100 мкл, в котором на долю экстракта приходится 50—60%. Необходимые добавки удобнее всего вносить в виде 10-кратного исходного раствора, составляющего 0,1 конечного объема реакционной

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

297

Таблица 12. Конечные концентрации компонентов, необходимых для синтеза белка в экстрактах культур клеток млекопитающих

75—ПО мМ КС1 (или до 0,15 ? ацетат калия)1 1,5—2,5 мМ ацетат магния1

50 мкМ аминокислоты без метионина (или без другой аминокислоты в зависимости от того, какая меченая аминокислота используется) До 500 мкКи/мл [33 5]-метионина (или другой радиоактивной аминокислоты). 1 мМ АТР

5 мМ креатинфосфат 0,25 мМ GTP

0,18 мг/мл креатинфосфокиназы

0,5 мМ ДТТ (или 6 мМ 2-меркаптоэтанол)

0,4 мМ спермидин

30 мМ HEPES (довести рН до 7,5 раствором КОН) До 40 мкг/мл мРНК

! Оптимальные концентрации ионов К+ и Mg2+ зависят от природы транслируемой мРНК.

смеси, в котором концентрации компонентов подобраны с учетом их количества в клеточном экстракте. Исходный раствор можно хранить при —20 °С в течение нескольких недель. Инкубацию проводят при 30 или 37 °С. Кинетика включения аминокислот зависит не только от температуры, но и от концентрации экстракта и от того, трансляция какой мРНК — эндогенной или экзогенной — регистрируется. При трансляции эндогенной мРНК включение аминокислот обусловлено в значительной степени завершением синтеза предсуществовавших полипептидов, а не инициацией in vitro.

Оптимальные концентрации Mg2+ и К+ особенно сильно зависят от природы транслируемой мРНК и колеблются в пределах, указанных в табл. 12. Для некоторых крупных РНК, соответствующих, например, геномам вирусов полиомиелита или энцефаломиокардита, оптимальные концентрации необычно высокие. По этим причинам, а также потому, что точные концентрации компонентов, необходимые для достижения максимального синтеза белка, могут зависеть от предшествующей обрабо