Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

ьном сцинтилляторе.

1 Эти методы можно использовать и для определения включения аминокислот в других системах трансляции, но при этом нет необходимости проводить обесцвечивание перекисью водорода.

шественников с высокой удельной радиоактивностью в низкой концентрации не всегда предпочтительно, хотя эта проблема чаще возникает с меченым лейцином, чем с [355]-метионином.

В составе лизата в реакционную смесь обычно вносится метионин в концентрации до 5 мкМ, лейцин в концентрации до 10 мкМ и несколько большее количество других аминокислот. Тем не менее, как правило, лизаты не фракционируют с помощью гель-фильтрации, чтобы понизить концентрацию эндогенных аминокислот, так как при этом будут удалены также

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

285

другие низкомолекулярные компоненты — полиамины, фосфаты Сахаров и субстраты, обеспечивающие восстановительный потенциал, что сильно нарушит весь белковый синтез. Обратить этот эффект можно, только если добавить все недостающие компоненты в лизат [2]. Сделать это не составляет труда, но нужно будет провести новые эксперименты по оптимизации.

Уровень включения аминокислот по окончании инкубации легко определить следующим образом. Наносят пипеткой небольшие аликвоты (2—10 мкл) на пронумерованные кружки фильтровальной бумаги Whatman № 1 и материал на бумаге осаждают ТХУ (табл. 6). Аминоацилированную тРНК гидро-лизуют прогреванием кружков в горячей ТХУ, образцы обесцвечивают перекисью водорода и определяют радиоактивность с помощью сцинтилляционного счетчика. Вместо этого некоторые исследователи переносят аликвоту из каждой реакционной смеси в 0,5 мл воды, добавляют NaOH для гидролиза амино-ацилированной тРНК. и перекись водорода (табл. 6). В этом случае гидролиз аминоацилированной тРНК. под действием NaOH и обесцвечивание перекисью водорода происходят одновременно. Белки осаждают добавлением ТХУ, затем фильтруют через стекловолокнистые фильтры и определяют радиоактивность, как описано.

Ориентировочная белоксинтезирующая эндогенная активность лизата после осаждения ТХУ аликвоты объемом 5 мкл из пробы, содержащей 4 мкКи/мл [14С]-лейцина (удельная радиоактивность 20 мКи/ммоль), должна в типичном случае давать 20 000 имп/мин за 60 мин инкубации. При вычислении количества синтезированного белка не забудьте учесть вклад эндогенных аминокислот в окончательную удельную радиоактивность меченого предшественника.

2.4. Обработка микрококковой нуклеазой

Важный шаг в использовании бесклеточных белоксинтези-рующих систем для трансляции экзогенных мРНК был сделан в 1976 г., когда Пелхэм и Джексон описали метод удаления эндогенной мРНК с помощью обработки лизатов ретикулоцитов микрококковой нуклеазой [3]. Изящество и простота данного подхода основаны на том, что активность этого фермента (из Staphylococcus aureus) полностью зависит от кальция, и поэтому после обработки ее можно подавить добавлением Са2+-хелатирующего агента ЭГТА. К тому же можно подобрать условия, при которых нуклеаза расщепляет мРНК, не подавляя биологической активности тРНК или рибосом. Таким образом, можно получить бесклеточную систему, в которой фоновое вклю-

286

Глава 9

чение аминокислот практически подавлено, но которая при этом транслирует добавленную мРНК с почти такой же эффективностью, как необработанная.

2.4.1. Приготовление лизата ретикулоцитов, обработанного нуклеазой

В табл. 7 описана простая процедура получения обработанного нуклеазой лизата ретикулоцитов, зависящего от мРНК. Метод состоит по существу всего из двух этапов. Вначале лизат инкубируют с микрококковой нуклеазой в присутствии 1 мМ СаСЬ в течение 15—20 мин при 20 °С. Затем добавляют ЭГТА до концентрации 2 мМ и переносят смесь в лед. Ее можно либо сразу же использовать для проведения трансляции, либо хранить в аликвотах в жидком азоте. Чтобы предотвратить активацию репрессора трансляции, контролируемую гемом, в реакционную смесь следует добавить гемин (40 мкМ) (разд. 2.2). Впоследствии, когда обработанный нуклеазой лизат ретикулоцитов используют для трансляции in vitro, конечная концентрация гемина составит 20 мкМ, так как при приготовлении реакционной смеси на долю лизата приходится 50% конечного объема (табл. 4). Если оптимальная концентрация гемина для необработанного лизата (разд. 2.2) меньше 20 мкМ, при обработке микрококковой нуклеазой следует добавить соответственно меньше гемина. Во время обработки нуклеазой можно также добавить креатинфосфокиназу, хотя ее присутствие на этой стадии не обязательно. В одной статье [9] сообщается, что для инактивации нуклеазы в клеточном экстракте лучше использовать 120 мкМ тимидин-3',5'-бисфосфат, чем ЭГТА.

Таблица 7. Получение лизата ретикулоцитов, обработанного микрококковой нуклеазой

1. Добавьте к лизату исходные растворы 0,2 ? СаС12 и 1 мМ гемина (табл. 3) до конечных концентраций 1 мМ и 40 мкМ1 соответственно.

2. Добавьте микрококковую нуклеазу до концентрации 25—100 ед/мл и проинкубируйте 15—20 мин при 20°С.

3. Добавьте 0,1 ? ЭГТА (рН 7,0) до конечной концентрации 2 мМ и перенесите лизат в лед.

4. Обработанный нуклеазой лизат можно сразу же использовать или заморозить порциями в жидком азоте.

1 Поскольку при добавлении в реакционную смесь лизат разводится вдвое (табл. 4), конечная концентрация гемина при трансляции in vitro составит 20 мкМ. Если оптимальная концентрация гемина для необработанного лизата (разд. 2.2) меньше 20 мкМ, при обработке нуклеазой следует соответственно снизить концентрацию гемина.

Оптимальная конечная концентрация нуклеазы составляет около 100 ед/мл, но она может колебаться для разных экстрактов и должна быть определена для каждого нового препарата.

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстр актах_287

Если концентрация низка, не все эндогенные мРНК будут инак-тивированы и останется высокий фон синтеза белка. Избыток фермента повредит рибосомы и тРНК, и в результате добавление мРНК будет слабее стимулировать включение аминокислот.

2.4.2. Условия реакции для осуществления трансляции экзогенной мРНК

Для трансляции экзогенных мРНК в лизате ретикулоцитов, обработанном нуклеазой, используются практически такие же условия, как в случае необработанного лизата (разд. 2.3) с весьма незначительными модификациями: обычно в инкубационную среду добавляют тРНК (из печени теленка) до концентрации 50 мкг/мл. Это обусловлено не разрушением эндогенной тРНК, а тем, что популяция тРНК ретикулоцитов соответствует аминокислотному составу глобинов кролика и может оказаться не оптимальной для трансляции других мРНК, например мРНК вируса табачной мозаики (ВТМ) [3]. Кроме того, возможно, придется снова оптимизировать систему по концентрации Mg2+, чтобы компенсировать слабую хелатирующую способность избытка ЭГТА по отношению к этому иону.

Лизат ретикулоцитов, обработанный нуклеазой, необычайно чувствителен к низким концентрациям мРНК: трансляция наблюдается при концентрации мРНК всего 0,3 мкг/мл. С другой стороны, некоторые мРНК эффективно транслируются при концентрации до 200 мкг/мл. Для каждого препарата РНК следует построить кривую зависимости включения аминокислот от концентрации мРНК, в том числе и контрольную кривую без добавления мРНК, а также с добавлением определенного количества стандартной мРНК, которая уже охарактеризована в отношении трансляции. Чтобы гарантировать синтез полноразмерных полипептидов, реакционные смеси следует инкубировать до 2 ч при 30 °С. Препараты РНК существенно различаются по способности стимулировать включение аминокислот. Как правило, вирусные РНК и глобиновая мРНК являются хорошими матрицами для лизата ретикулоцитов: при концентрации Б—20 мкг/мл они дают превышение включения над фоном в несколько сотен раз. Клеточные мРНК могут оказаться менее эффективными. И суммарная цитоплазматическая РНК, и выделенная poly (А)+-РНК стимулируют трансляцию. Однако суммарная цитоплазматическая РНК должна использоваться в гораздо более высоких концентрациях (100—200 мкг/мл: см. рис. 2), поскольку большая ее часть приходится на долю рРНК. В пробы можно добавлять большие объемы растворов мРНК при условии, что они содержат не очень много солей (особенно Mg2+). Слишком разведенные растворы (в воде) можно лио-

288

Глава 9

О 100 200

Цитоплазматическая РНК, мкг/мл

Рис. 2. Трансляция препаратов экзогенной суммарной цитоплазматиче-ской РНК в системе лизата ретикулоцитов, обработанного нуклеазой. Суммарную цитоплазматическую РНК выделяли из разведенного в шесть раз лизата ретикулоцитов, как описано в гл. 8, табл. 3. Различные количества РНК транслировали in vitro в условиях, описанных в табл. 4, в течение 60 мин при 30°С; затем отбирали аликвоты по 10 мкл для определения включившейся в белки радиоактивности, как описано в табл. 6. Приведены данные для двух разных препаратов РНК: / — РНК из контрольного лизата, проинкубированного в течение 60 мин; // — РНК из лизата, проинкубированного в течение 60 мин с 2',5'-олигоаденилатом (см. рис.6). Второй препарат РНК частично деградировал под действием эндонуклеазы, активированной 2',5'-олиго-аденилатом.

филизировать в пробирках для последующей инкубации и растворять РНК прямо в реакционной смеси. Некоторые препараты РНК могут содержать ингибиторы трансляции, например сульфатированные полисахариды или двухцепочечную РНК. Присутствие ингибиторов можно обнаружить, добавляя препараты РНК к инкубационным смесям, содержащим известное количество стандартной, хорошо транслируемой мРНК. Правда, даже если наблюдается низкая стимуляция белкового синтеза при добавлении РНК, стоит все-таки попытаться выявить специфические продукты трансляции с помощью гель-электрофореза или какого-либо другого метода (разд. 5).

2.5. Достоинства и недостатки

Система лизата ретикулоцитов в своем первоначальном виде или после обработки микрококковой нуклеазой в настоящее время, по всей вероятности, является наиболее широко используемой эукариотической бесклеточной белоксинтезирующей системой. Для этого есть ряд причин: прежде всего высокая активность трансляции эндогенных и экзогенных мРНК, относительная

страница 65
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(09.08.2020)