ельности

По мере изучения нуклеотидных последовательностей мРНК эукариотических клеток появлялись методы фракционирования мРНК на основании особенностей их первичной структуры.

Аффинная хроматография на oligo(dT)-целлюлозе. Этот метод чаще всего используют для очистки молекул мРНК, имеющих на З'-конце цепочку poly (А), т. е. полиаденилированных р01у(А)+-мРНК. Процедуры, которые используются в разных лабораториях, очень сходны и различаются лишь в деталях. Обычно до 10 мг суммарной РНК медленно наносят на небольшую колонку (1—2 мл) при комнатной температуре в буфере, содержащем 0,5 ? NaCl или КО, 1 мМ ЭДТА," 0,1% ДСН1, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, колонку промывают большим объемом этого раствора (табл. 14). РНК, не имеющие poly (А) (в основном рРНК и тРНК), не связываются с oligo(dT)-целлюлозой и проходят через колонку. Poly(А)+-мРНК связывается с колонкой, и ее можно затем элюировать, понижая ионную силу элюента. Обычно для более полного удаления примесей рРНК ро1у(А)+-мРНК пропускают через колонку еще раз. Затем ее осаждают этанолом в присутствии 0,3 ? ацетата натрия (рН 5,2) (табл. 14). Кристосек и др. [28] показали, что можно-вызвать диссоциацию полисом в буфере, содержащем ДСН,

1 Если в растворе присутствуют ионы калия, вместо ДСН следует брать ?-лаурилсаркозинат натрия. — Прим. перев.

272

Глава 8

Таблица 14. Очистка матричной РНК хроматографией на оПдо((1Т)-целлюлозе1

1. Суспендируйте oligo(dT)-целлюлозу в стерильном буфере для нанесения с высокой ионной силой:

0,5 ? NaCl (или КС1) 1 мМ ЭДТА 0,1% ДСН

10 мМ трис-HCl, рН 7,5

2. Набейте колонку объемом 1—2 мл (стерильный шприц или пастеровская пипетка) этой oligo(dT)-целлюлозой. Промойте ее следующими растворами (в указанном порядке):

1) Н20

2) 0,1 ? NaOH, 5 мМ ЭДТА

3) Н20

Продолжайте отмывку oligo(dT)-целлюлозы водой, пока рН не станет близким к нейтральному.

3. Снова уравновесьте колонку стерильным буфером для нанесения.

4. Прогрейте раствор РНК в воде 5 мин при 65 °С. Добавьте равный объем двукратного буфера для нанесения, охладите и нанесите на колонку.

5. Соберите РНК, не связавшуюся с колонкой, прогрейте при 65 °С и еще раз нанесите на колонку, как в п. 4.

6. Промывайте колонку буфером для нанесения (не менее 5 объемов колонки), пока Л2бо вытекающего раствора не упадет практически до нуля.

7. Элюируйте poly(A)+-PHK стерильным буфером с низкой ионной силой:

1 мМ ЭДТА 0,05% ДСН

10 мМ трис-HCl, рН 7,5

8. Доведите концентрацию соли в растворе poly(A)+-PHK снова до 0,5 ? NaCi или КС1 и повторите операции пп. 3—7.

9. Добавьте к ро1у(А)+-РНК ацетат натрия, рН 5,2, до концентрации 0,3 ? и осадите РНК 2,5 объемами этанола в течение ночи при —20 °С.

10. Соберите РНК центрифугированием (10 000g', 10 мин), промойте осадок 70%-ным этанолом, высушите и растворите в стерильной воде. Храните при — 70 °С.

11. Регенерируйте oligo(dT)-целлюлозу, промыв ее 0,1 ? NaOH, 5 мМ ЭДТА, затем водой и наконец буфером для нанесения, как указано в пп. 2 и 3.

1 Можно модифицировать процедуру так, чтобы проводить ее не на колонке, а в пробирке. Для этого берут 0,6 г о^о(<1Т)-целлюлозы (сухой вес) на I мг РНК. Сорбент со связанной РНК многократно центрифугируют в буфере для нанесения, чтобы отмыть от несвязавшейся РНК, а затем элюируют РНК буфером с низкой ионной силой. Этот метод удобен, когда приходится обрабатывать одновременно много образцов.

и этот раствор непосредственно фракционировать на oligo(dT)-целлюлозе, минуя депротеинизацию.

Аффинная хроматография на ро1у(11)-сефарозе. Молекулы мРНК, имеющие короткие последовательности poly (А) на З'-кон-цах (менее 20 нуклеотидов), плохо связываются с oligo(dT)-целлюлозой, но их удается задержать на poly (U)-сефарозе, несущей более длинные цепочки аффинного лиганда. В этом случае для элюции poly (А)+-мРНК нужны более сильные денатурирующие условия (70—90% формамида) (табл. 15). мРНК можно также элюировать с таких аффинных колонок, не пони-

Выделение эукариотической матричной РНК

273

Таблица 15. Очистка матричной РНК хроматографией на ро1у(11)-сефарозе [30]

1. Суспендируйте poly (и)-сефарозу в стерильном буфере для элюции:

10 мМ ЭДТА

0,2% саркозила

90% формамида

10 мМ фосфат калия, рН 7,5

2. Перенесите суспензию в стерильный шприц, чтобы получить колонку размером 0,5x2,0 см.

3. Промойте колонку 3 мл буфера для элюции.

4. Промойте колонку 3 мл стерильного буфера для нанесения:

0,5 ? NaCl

10 мМ ЭДТА

25% формамида

50 мМ трис-HCl, рН 7,5

5. Растворите РНК в буфере для нанесения и нанесите на колонку.

6. Проэлюируйте несвязавшуюся РНК тремя порциями буфера для нанесения по 1 мл.

7. Проэлюируйте связавшуюся poly(A)+-PHK шестью порциями буфера для элюции по 0,25 мл (п. 1).

8. Осадите РНК этанолом, как описано в табл. 14, пп. 9 и 10.

9. Регенерируйте ро1у(и)-сефарозу, уравновесив ее буфером для нанесения (п. 4).

жая ионную силу, а повышая температуру [30, 31]. Этот подход получил дальнейшее развитие для фракционирования poly(A)+-мРНК по длине poly (А) на основе элюции различных фракций при ступенчатом повышении температуры {29]. Сходный метод был использован для хроматографии частиц мРНП Haoligo(dT)-целлюлозе [32].

Очистка ро1у(А)+-мРНК другими методами. Присутствие poly (А)-последовательностей в мРНК сообщает им ряд новых свойств, которые можно использовать для их выделения. Если проводить фенольную экстракцию при нейтральном рН, poly (А)+-мРНК переходят в фенольную фазу, а при повторной экстракции при рН 9,0 их можно перевести в водную фазу [33]. Кроме того, они связываются с немодифицированной целлюлозой [34] и с фильтрами типа Millipore, сделанными из эфиров целлюлозы, в 0,5 ? KCI [35]. Связавшуюся с фильтрами и целлюлозой фракцию можно затем элюировать 0,05%-ным ДСН при низкой ионной силе. Однако ни один из этих подходов не обладает такой специфичностью, как аффинная хроматография на oligo(dT)-целлюлозе или poly(U)-сефарозе.

Выделение ро1у(А)--мРНК. Выделение клеточных мРНК, не содержащих З'-концевых poly (А)-последовательностей, представляет собой более сложную проблему. Гринберг [36] описал метод, основанный на различии в плавучей плотности диссоциированных в присутствии ЭДТА рибосом и мРНП-частиц в градиенте сульфата цезия, содержащем 15% ДМСО. Фракцию

18-953

274

Глава 8

мРНП депротеинизируют и разделяют на популяции poly(A)+-и poly (А)_-мРНК, как описано выше.

Выделение индивидуальных мРНК. Если имеется ДНК, комплементарная последовательности индивидуальной мРНК, то можно выделить мРНК методом селективной гибридизации. ДНК иммобилизуют на нитроцеллюлозе или химически активированной бумаге и затем используют для связывания индивидуальной мРНК После элюции ее добавляют в систему in vitro, где она транслируется с образованием определенных полипептидных продуктов [37, 38]. Этот метод имеет большие перспективы и получит широкое распространение, когда клонированные ДНК станут более доступны в качестве гибридизационных зондов. Одна из методик выделения мРНК этим методом описана в гл. 2, табл. 4.

2.7. Ингибиторы рибонуклеаз

В настоящей главе уже рассмотрен ряд методов подавления рибонуклеазной активности (разд. 2.1—2.4 и табл. 1). В дополнение к этим общим подходам существует ряд специальных способов ингибирования рибонуклеазной активности при выделении мРНК, которые вкратце суммированы ниже.

Гепарин. Этот сульфатированный полисахарид широко используется в качестве ингибитора рибонуклеаз. Он адсорбирует нуклеазы и конкурентно ингибирует их. Добавление этого соединения в буферы в концентрации 1 мг/мл при получении субклеточных фракций и полисом может существенно улучшить выход и трансляционную активность очищенной мРНК Однако гепарин следует удалить из препарата РНК перед проверкой в системе трансляции, так как он является ингибитором инициации полипептидной цепи. Для удаления гепарина спиртовой осадок РНК промывают ЗМ ацетатом натрия или 2? хлористым литием. Другие полианионы, например поливинилсульфат, действуют подобно гепарину [39], видимо связывая рибонуклеазы и конкурируя таким образом с РНК. В ранних работах для адсорбции рибонуклеаз использовали диатомовую землю (бентонит), но она не ингибирует их полностью.

Белки — ингибиторы рибонуклеаз. Из печени крысы и из плаценты человека были выделены и очищены белки, которые связываются с рибонуклеазой и обратимо ее ингибируют. Ингибитор из плаценты имеется в продаже (табл. 2). Он применяется не только для предотвращения деградации полисом при получении клеточных субфракций и деградации РНК во время ее выделения (табл. 4); его добавляют также вместе с экзогенной мРНК в бесклеточную систему трансляции из зародышей пшеницы для увеличения выхода продуктов трансляции (гл. 9, разд. 3.2) [40].

Выделение эукариотической матричной РНК

275

Протеиназа К- Фермент протеиназа К полезен тем, что функционирует в присутствии ДСН и быстро инактивирует нуклеазы из многих источников. Его рекомендуется применять также для уменьшения белковой интерфазы, образующейся при фенольной экстракции (табл.4).

Другие агенты, подавляющие рибонуклеазную активность. В некоторых случаях хороший эффект дают комплексы ванадия ¦с рибонуклеозидами: эти комплексы связываются с рибонук-леазами и инактивируют их (табл. 4). В других случаях защитить полисомы от деградации во время выделения может простая мера предосторожности — увеличение концентрации Mg2+ до 50 мМ и выше [41].

Благодарности

Я благодарен за финансовую поддержку, полученную от Общества борьбы с раком.

Литература

1. Lodish ?. F. Annu. Rev. Biochem., 45, 39 (1976).

2. Moldave K., Grossman L., eds. Methods in Enzymology, vol. 60, published by Academic Press, Inc., New York and London, 1979.

3. Ehrenberg L., Fedorcsak I., Solymosy F. In: Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, vol. 16, Cohn W. E. (ed.), Academic Press, Inc., New York and London, p. 189, 1976.

4. Taylor J. M. Annu. Rev. Biochem., 48, 681 (1979).

5. Verma D. P. S., Maclachlan G. ?., Byrne H., Ewings D. J. Biol. Chem, 250 1019 (1975).

•6. Shore G. C, Tata