плексы полисом с первичными антителами могут быть адсорбированы на аффинной колонке, к носителю которой ковалентно пришит нерастворимый антиген [25].

Все эти методы с успехом применялись для многих объектов, в частности, весьма удачно были выделены мРНК яичного белка из яйцеводов кур и мРНК сывороточного альбумина из печени [4, 22]. После экстракции из иммунопреципитатов эти РНК были получены в интактном виде и с высоким выходом. Пайвар и Шимке [24] выяснили некоторые наиболее важные условия успешной иммунопреципитации мРНК. К ним относятся высокая степень чистоты исходного антигена, который используется для получения антител; очистка специфических антител от рибонуклеазных примесей; и снижение неспецифического осаждения полисом в иммунопреципитатах. Если эти условия соблюдены, то можно очистить индивидуальную мРНК, составляющую всего 1% всей популяции мРНК

268

Глава 8

2.4.4. Выделение мРНК из полисом

РНК легко получить как из препарата суммарных полисом, так и из полисомных фракций, выделенных на основании их ассоциации с мембранами, размера или способности к иммуно-преципитации специфическими антителами. Принципы выделения при этом те же, что и при выделении суммарной клеточной или цитоплазматической РНК (разд. 2.3), т. е. депротеинизация полисом, разделение белка и РНК, и осаждение, и промывка РНК- Две подобные методики приведены в табл. 11.

Таблица 11. Выделение РНК из очищенных полисом

Метод выделения в градиенте сахарозы в присутствии ДСН (23, 26].

1. Добавьте к суспензии полисом или комплекса полисом с антителами ЭДТА до 50 мМ, NaCl до 0,1 ? н ДСН до 1%· Если нужно, доведите рН до 7,0, добавив 0,2 объема 1,0 ? трис-HCl, рН 7,0.

2. Добавьте 2 объема этанола и оставьте смесь не менее чем на 6 ч при —20 °С, чтобы сформировался осадок РНК.

3. Отцентрифугируйте 20 мин при 14 000g при 0°С.

4. Растворите осадок в 0,5%-ном ДСН, 5 мМ ЭДТА, 20 мМ ацетате натрия, рН 5,0. Наслоите раствор на градиент сахарозы 5—20%, приготовленный на таком же буфере, и отцентрифугируйте 6 ч (195 000g, 20 °С, в роторе Beckman SW41 или эквивалентном ему).

5. Пропустите градиент через проточный денситометр, регистрирующий поглощение при 260 нм, и соберите материал, находящийся в нижней части пробирки (>10S). Осадите РНК этанолом, как описано в пп. 1 и 2*.

Метод выделения с помощью протеиназы К и фенола [16]

1. Добавьте суспензию полисом к равному объему горячего (100 °С) ДСН-бу-фера:

1% ДСН

0,2 ? NaCl

40 мМ ЭДТА

20 мМ трис-HCl, рН 7,4

Проинкубируйте 2 мин при 100 °С.

2. Быстро охладите смесь до 30 °С и добавьте протеиназу К до концентрации 0,5 мг/мл. Проинкубируйте 10 мин при той же температуре.

3. Добавьте концентрированный раствор трис-HCl, рН 9,0, до 0,1 ? и ДСН до 1% и экстрагируйте трижды равным объемом смеси фенол — хлороформ (1 : 1, по объему), как описано в табл. 3 (пп. 4 и 5), отбрасывая каждый раз фенольный слой.

4. Осадите РНК из водной фазы, добавив 2,5 объема этанола и 0,1 объема 2 ? ацетата натрия, рН 5,2. Оставьте на ночь при — 20 °С. Отцентрифугируйте осадок РНК-

1 Центрифугирование в градиенте сахарозы позволяет отделить мРНК и рРНК от гРНК, денатурированных белков н гепарина, которые остаются в верхней части градиента. Дальнейшую очистку от этих молекул проводят следующим образом. Спиртовой осадок РНК промывают 2,0 ? LiCl, 5 мМ ЭДТА. а затем 3 ? ацетатом натрия, рН 5,5, 5 мМ ЭДТА и, наконец, 70%-ным этанолом, содержащим 0,15 ? NaCl.

2.5. Выделение вирусной РНК

Выделение РНК вирусов эукариот основано в основном на тех же принципах, что и выделение клеточной РНК (разд. 2.3). Если имеется очищенный препарат вируса, то из вирионов

Выделение эукариотической матричной РНК

269

Таблица 12. Выделение РНК из очищенного вируса энцефаломиокардита1

1. Суспендируйте очищенный вирус в концентрации 1 мг/мл в 10 мМ 2-мер-каптоэтаноле, 50 мМ трис-HCl, рН 7,6, и добавьте 112 мкл 5%>-ного дезоксихолата натрия и 125 мкл 0,1 ? ЭДТА на каждый миллиметр суспензии вируса.

2. Проинкубируйте 2 мин при 42 "С, а затем добавьте равный объем теплого (42 °С) фенола, предварительно уравновешенного 50 мМ трис-HCl, рН 7,6. Перемешивайте в течение 6 мин, поддерживая температуру 42 °С.

3. Охладите смесь в течение 10 мин во льду и затем отцентрифугируйте 10 мин при 10 000g при 4°С. Отберите водный слой, стараясь не загрязнить его материалом интерфазы.

4. Еще раз проэкстрагируйте фенольный слой половинным объемом 50 мМ трис-HCl, рН 7,6, и снова отцентрифугируйте, как в пп. 2 и 3. Объедините водный слой с раствором, полученным в п. 3.

5. Осадите РНК из объединенной водной фазы, добавив 2,5 объема этанола и КС1 до концентрации 0,1 М. Проинкубируйте при —20 °С в течение ночи.

6. Осадите РНК центрифугированием при 2000g в течение 5 мин при 4 °С.

7. Тщательно осушите осадок РНК при —20 "С, а затем ресуспендируйте его в 1 мл 70%-ного этанола. Отцентрифугируйте, как указано в п. 6.

8. Повторите операции п. 7.

9. Осушите осадок РНК и растворите его в небольшом объеме стерильной воды. Разведите небольшую аликвоту и измерьте поглощение при 260 нм, чтобы определить концентрацию РНК, как описано в тексте (разд. 2.3.1).

10. Храните раствор РНК в небольших аликвотах при — 70 °С.

1 Эта методика приведена в качестве примера одной из множества процедур, которые были разработаны для различных вирусов. Методы выделения РНК из других вирусов можно найти в оригинальных работах.

сравнительно легко получить нуклеиновую кислоту фенольным методом (табл. 12) или методом солевой экстракции [26]. Вирусные частицы разрушают детергентом (ДСН или дезокси-холатом натрия) в присутствии ЭДТА, а затем добавляют фенол. После обычного перемешивания и разделения фаз центрифугированием фенольный слой повторно экстрагируют свежей порцией буфера и водные фазы объединяют. Часто дополнительно экстрагируют этот раствор новыми порциями фенола. В некоторых случаях эти обработки проводят при повышенной температуре (чаще всего при 42 °С). Вирусную РНК осаждают этанолом, промывают и в дальнейшем обращаются с ней точно так же, как и с другими препаратами РНК-

Выделение вирусных РНК из зараженных или трансформированных вирусом клеток проводят в основном так же, как и из подобных незараженных клеток (разд. 2.3). В действительности многие виды вирусных РНК можно получить только таким путем, поскольку РНК, участвующие в процессах вирусной репликации или трансформации клеток, часто не идентичны тем РНК, которые обнаруживаются в составе вирионов. На поздних стадиях литического заражения синтез белков клетки-хозяина обычно подавлен и преобладает трансляция вирусных полипептидов.

270

Глава 8

Поэтому выделение полисомной РНК (см. разд. 2.4) на соответствующих стадиях заражения может дать фракцию мРНК, существенно обогащенную определенными вирусными последовательностями. Однако некоторые клеточные мРНК обычно остаются в неполисомной и даже в полисомной фракциях, поэтому в дальнейшем может понадобиться дополнительная очистка вирусных РНК. Соответствующие методики приведены в следующем разделе.

2.6. Фракционирование РНК

После выделения суммарной клеточной РНК, цитоплазматической РНК, полисомной РНК, неполисомной РНК или полисомной РНК из иммунопреципитата с помощью описанных выше методов можно переходить к следующей стадии — удалению из суммарного препарата ненужной мРНК. Для этого существует несколько методов, которые можно в целом разделить на две группы: фракционирование РНК по размеру и по нуклео-тидной последовательности.

2.6.1. Фракционирование РНК по размеру

Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы. Этот метод широко использовался для разделения различных классов РНК по молекулярной массе или по седиментационным свойствам. Коэффициенты седиментации мРНК составляют 6— 35 S и более, причем большинство попадает в интервал 16— 20 S. Поэтому центрифугирование в градиенте сахарозы особенно полезно при очистке очень длинных или очень коротких мРНК, а также для отделения многих мРНК от тРНК и более крупных (28 S) рРНК. Основная проблема заключается в том, как избежать агрегации РНК во время осаждения через сахарозу. Агрегацию можно свести к минимуму, если прогреть РНК перед фракционированием втечение 10 мин при65°С или проводить разделение в сахарозе в денатурирующих условиях. Во втором случае РНК растворяют в буфере, содержащем такие денатурирующие агенты, как 0,5%-ный ДСН, или99%-ный диметилсуль-фоксид (ДМСО), или 70%-ный формамид, которые вводят в состав градиента. Методика центрифугирования в 70%-ном фор-мамиде приведена в табл. 13. После центрифугирования РНК осаждают из соответствующих фракций этанолом.

Гель-электрофорез. Электрофорез в препаративных ПААГ или агарозных гелях в денатурирующих условиях, например в присутствии метилртутьгидроксида, также широко используется для фракционирования различных классов РНК. С его помощью получают большие количества чистых мРНК, способных

Выделение эукариотической матричной РНК

271

Таблица 13. Фракционирование РНК в градиенте плотности сахарозы в денатурирующих условиях

1. Приготовьте градиенты сахарозы 5—20% в 3 мМ ЭДТА, 70%-ном форма-миде, 3 мМ трис-HCl, рН 7,9'.

2. Растворите РНК в том же буфере, наслоите ее на градиент и отцентрифугируйте 20 ч при 186 000g при 25 °С2 в роторе Beckman SW41 или эквивалентном ему.

3. После центрифугирования пропустите градиент через проточный денситометр, регистрирующий поглощение при 260 нм. Раскапайте градиент на фракции. Осадите РНК в нужных фракциях, добавив 2,5 объема этанола и NaCl до 0,2 М. Оставьте на ночь при —20 °С и отцентрифугируйте осадок РНК.

1 Можно использовать и градиенты, приготовленные на других буферных растворах, содержащих, например, 5мМ ЭДТА, рН 7,4, 0,5%-ный ДСН или 10 мМ LiCl, 1 мМ ЭДТА, 99%-ный ДМСО вместо 70%-ного формамида.

2 Оптимальное время центрифугирования зависит от размера интересующей исследователя РНК.

к активной трансляции. Подобные методы были подробно рассмотрены в литературе [27] и поэтому здесь обсуждаться не будут.

2.6.2 Фракционирование по нуклеотидной последоват