Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

Все это приспособление должно обеспечить подачу раствора ДНК из микропипетки в клетки под постоянным давлением при помощи шприца фирмы Hamilton (модель 8700).

4. Наберите раствор ДНК (0,1 мг/мл в PBS1) в микропипетку.

5. Пользуясь шприцем фирмы Hamilton, вводите раствор ДНК в клетки под постоянным давлением. Количество жидкости, вводимой в каждую клетку, контролируется с точностью У/2^У^2У путем визуального наблюдения за изменением показателя преломления внутриклеточной среды по мере поступления жидкости в клетку и временем, в течение которого микропипетка находится в клетке.

6. После того как донорная ДНК введена в клетки, должна осуществляться предселективная экспрессия перенесенного гена (генов), и затем нужно отобрать трансформанты в соответствии с табл. 1.

1 Состав буфера приведен в табл. 3, п. 1.

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

27

28

Глава I

активность [24]. Количество получаемых стабильных трансформантов зависит от природы инъецированной рекомбинантной ДНК. Например, используя рекомбинантную ДНК pBR322/ /HSV-1, несущую ген tk, можно получить лишь одну стабильно трансформированную клетку на 500—1000 клеток, в которые вводилась эта ДНК. В то же время, если к рекомбинантной ДНК pBR322/HSV-l tk присоединить специфические последовательности ДНК SV-40, частота трансформации повысится до 20% от числа клеток, в которые была осуществлена микроинъекция (см. также разд. 5.3).

Микроинъекцию в клетки млекопитающих можно проводить так, как это описано в табл. 8. Средний объем, инъецированный в каждую клетку (10—20 фемтолитров), определяют так. В 5000 клеток инъецируют [3H]-dTTP (10 мкКи/мкл), промывают клетки буфером PBS и затем измеряют радиоактивность клеток с помощью сцинтилляционного счетчика. Для L-клеток этот объем составляет 1—2% объема клетки. В течение 1 ч можно провести инъекцию 500—1000 клеток, причем вероятность успешного переноса составляет 50—100% [24]. Аналогичные методы инъецирования макромолекул в культивируемые клетки млекопитающих описаны в работах [21—23]. Процедура микроинъекции схематически изображена на рис. 6.

2.3.2. «Прокалывание»

Одним из вариантов стандартного метода микроинъекции является метод «прокалывания», при котором ДНК механически вводят в ядра культивируемых клеток [25]. Этот метод описан в табл. 9 и проиллюстрирован на рис. 6. Клетки в логарифмической фазе роста обрабатывают трипсином и ЭДТА, промывают средой и затем рассевают по 1—5-103 клеток на чашки Петри диаметром 6 см и инкубируют при 37°С в течение ночи. Непосредственно перед «прокалыванием» среду сливают и клетки промывают два раза буфером PBS, рН 7,2, а затем наслаивают буфер PBS, содержащий донорную ДНК в концентрации 5—1000 мкг/мл. Все клетки в определенном помеченном секторе чашки «прокалывают» один раз в области ядра стеклянной микроиглой, пока кончик микроиглы не коснется подложки. Клетки в других секторах чашки служат контролем. Сразу после «прокалывания» среду заменяют нормальной ростовой средой, чтобы провести предселекцию, затем ее в свою очередь заменяют подходящей селективной средой.

Введение ДНК, суспендированной во внешней среде, в ядра реципиентных клеток при «прокалывании» было продемонстрировано для ьАТК~-клеток мыши с донорной ДНК HSV-1, не-

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

Таблица 9. Введение ДНК в клетки млекопитающих методом «прокалывания» [25]

1. Сделайте микроиглы из стеклянных капилляров с помощью приспособления для вытягивания микроэлектродов (например, Narishige PN-3 в следующем режиме: нагреватель «8», магнит «10», главная, мишень «10»). Диаметр кончика мнкроиглы должен быть порядка 0,1 мкм.

2. Трилсинизируйте клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста, обработав их 0,25%-ным трипсином в присутствии 0,02%-го ЭДТА в течение: 15 мин при 37"С.

3. Промойте трипсинизированные клетки свежей средой.

4. Суспендируйте клетки в свежей среде и определите концентрацию клеток, в суспензии.

5. Посейте по 100—200 клеток на помеченный участок (площадью ~0,5 см2)< каждой чашки Петри.

6. Проинкубируйте клетки 5 ч при 37 °С, чтобы они смогли прикрепиться: к подложке.

7. Непосредственно перед «прокалыванием» слейте среду и промойте клетки^ дважды 100 мкл буфера PBS1.

8. Наслоите на клетки 50 мкл PBS, содержащего ДНК в концентрации-5—1000 мкг/мл.

9. С помощью микроскопа с манипулятором (инъектоскопа) (например, Olympus IMI-YF, type 1) «проколите» клетки. Зафиксируйте микроиглу в держателе, находящемся в углублении, перпендикулярно оптической оси конденсора. «Проколите» клетки движением конденсорной линзы вверх-вниз.

10. После «прокалывания» замените среду нормальной ростовой средой и создайте условия для предселективной экспрессии перенесенных генов' (табл. 1, п. 8).

11. Наконец, проведите селекцию по перенесенному гену, например, так, как. это описано в табл. 1, пл. 9—11 для №-гена.

1 Состав этого буфера дан в табл. 3, п. !.

сущей ген tk. Примерно у 25% клеток, «проколотых» в присутствии этой рекомбинантной ДНК, наблюдалась экспрессия гена tk, а 2% клеток становились ТК+-трансформантами [25].

2.4. Липосомы как переносчики генов

Использование липосом для переноса генов и исследования-их экспрессии подробно описаны в работах [12, 26, 27]. Уонг и др. [26] показали, что ген ?-лактамазы из плазмиды pBR322 можно ввести в отрицательно заряженные липосомы с помощью обработки ультразвуком. При инкубации таких липосом с клетками различных культур в клеточных экстрактах появляется ?-лактамазная активность. Позже перенос генов с помощью липосом был использован для трансформации ЬАТК--клеток мыши рекомбинантной плазмидой, несущей tk-гея HSV-1 [27].

Для получения липосом с включенными в них ДНК лучше всего использовать метод выпаривания с обращением фазы (28); при этом образуются большие однослойные пузырьки с высокой?

-30

Глава 1

Таблица 10. Приготовление и использование липосом, содержащих ДНК [27]

Приготовление липосом, содержащих ДНК

1. Смешайте фосфатидилсерин и холестерол (Sigma) в молярном отношении 1:1. Для этого растворите по 10 микромолей каждого компонента в 1 мл диэтилового эфира.

2. Добавьте 0,33 мл буфера PBS1, содержащего 20—200 мкг рекомбинантной плазмидной ДНК.

3. Подвергните эту двухфазную систему кратковременной обработке ультразвуком (10 с), используя ультразвуковой излучатель В-15 Branson Sonifier с микронасадкой, установленный на 500 мс. После такой обработки получится гомогенная эмульсия.

4. Удалите эфир, перелив эмульсию во вращающуюся колбу, соединенную с лнофильным испарителем. В результате получится гомогенная опалесци-рующая суспензия липосом.

5. Отделите свободную, т. е. не попавшую в липосомы, ДНК центрифугированием препарата при 100 000 g' 30 мин. Обычно около 10—20% ДНК включается в липосомы.

¦6. Ресуспендируйте осадок (липосомы, содержащие ДНК) в 1 мл PBS. 7'рансфекция с использованием липосом, содержащих ДНК

1. Приготовьте серийные разведения суспензии липосом в ростовой среде.

2. Добавьте по 100 мкл липосом, содержащих 10—500 нг ДНК, прямо во флаконы с реципиентными клетками (площадь роста 25 см2), подготовленными в точности так, как описано в табл. 1 для кальций-фосфатного метода трансфекции.

3. Оставьте липосомы с клетками на ночь в термостате при 37 °С.

4. Отберите стабильные трансформанты. Методика отбора зависит от маркерного гена, по которому должна проводиться селекция (разд. 3 и 5, табл. 1, 2, 15 и 16). Можно также исследовать временную экспрессию (разд. 5.1).

1 Состав этого буфера приведен в табл. 3, п. 1.

эффективностью включения ДНК. Этот метод детально описан в табл. 10; там же приведены данные по использованию липосом, содержащих ДНК, для трансфекции клеток млекопитающих.

Потенциальные возможности метода переноса ДНК в клетки млекопитающих с помощью липосом были тщательно исследованы в случае клеток почек обезьяны и ДНК SV40 [12]. За включением ДНК, проявляющемся в образовании вирусных частиц, можно следить с помощью чувствительных методов бляшек и флуоресцентного анализа. ДНК SV40, заключенная в липосомы, по крайней мере в 100 раз более инфекционна (1,8· 103 БОЕ/мкг ДНК), чем изолированная ДНК. Однако ее инфекционность значительно меньше той, которую можно по-.лучить (5-Ю6 БОЕ/мкг ДНК), используя ДЭАЭ-декстрановый метод (разд. 2.2). Инфекционность ДНК, включенной- в липосомы, можно повысить в 10—200 раз, обработав клетки через 30 мин после добавления липосом полиэтиленгликолем или гли-церолом в высокой концентрации в течение 90 с [12]. Хотя и в этом случае эффективность липосомного метода остается

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

31

в 10 раз ниже ДЭАЭ-декстранового, он обладает такими преимуществами, как низкая токсичность и возможность применения in vivo. Захват липосом клетками, по-видимому, осуществляется путем эндоцитоза, а не в результате слияния липосом с клеточной мембраной [29].

2.5. Слияние протопластов

Метод, с помощью которого, возможно, удастся преодолеть сложности включения ДНК в клетки млекопитающих и ее экспрессии, — метод слияния протопластов — был впервые описан1 в работе [30]. Он основан на слиянии протопластов, которые-получены из Escherichia coli, содержащих молекулы рекомби-нантных ДНК, с культивируемыми эукариотическими клетками в присутствии полиэтиленгликоля, способствующего слиянию. За прошедшие годы этот метод был настолько усовершенствован, что введение экзогенной ДНК и временная ее экспрессия: Таблица 11. Методика проведения слияния протопластов [31]

1. Вырастите культуру клеток Е, coli, несущих рекомбинантные плазмиды,. до концентрации 2-Ю8 клетка/мл.

2. Проинкубируйте культуру в присутствии хлорамфеникола (конечная концентрация 200 мкг/мл) в течение ночи, чтобы произошла амплификация' плазмид1.

3. Отцентрифугируйте пробы культуры объемом по 10 мл при 5000 g 10 мин и каждый осадок бактерий ресуспендируйте в 100 мкл охлажденного-во льду раствора следующего состава: 20%-ная сахароза, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0.

4. Добавьте 20 мкл свежеприготовленного лизоцима (10 мг/мл; Boehringer)

страница 6
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2019)